李文艷,張娜, 李曉寧,劉純甫,梁子騰,仲飛,管越強(qiáng)
(1.河北大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071002; 2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000;3.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071002;4.河北大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,河北 保定 071002)
單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)是一種在自然界中廣泛分布的可寄生于宿主細(xì)胞內(nèi)外的人獸共患病原菌,嚴(yán)重感染時(shí)可造成妊娠動(dòng)物和孕婦流產(chǎn)[1-2],但其作用機(jī)理尚不清楚.研究證實(shí),妊娠過程中母胎界面存在由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)平衡是妊娠得以成功的必要條件[3-5],其中Th1和Th2 型細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)平衡起著重要的作用[4-5].Th1細(xì)胞因子可激活細(xì)胞免疫和炎癥的發(fā)生,促進(jìn)免疫殺傷,不利于妊娠的進(jìn)行,主要包括白細(xì)胞介素-2(interleukin, IL-2) 、IFN-γ和TNF-α等,Th2細(xì)胞因子介導(dǎo)B細(xì)胞增殖和抗體的產(chǎn)生,有利于妊娠的進(jìn)行,主要包括IL-4 、IL-6 和IL-10等[5].正常妊娠應(yīng)是Th2 細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì),并且Th1和Th2細(xì)胞因子維持在動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài),一旦這種平衡被破壞,就可能導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[5].LM致小鼠流產(chǎn)是否與母胎界面Th1和Th2細(xì)胞因子失衡有關(guān),目前尚不清楚.因此,本實(shí)驗(yàn)分別用野生型(wild type,WT)和重要毒力因子溶血素O (listeriolysin O,LLO)基因缺陷型(Δhly)菌株感染妊娠小鼠和小鼠巨噬細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)其胚胎存活率,檢測(cè)母胎界面和巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中Th1和Th2細(xì)胞因子的表達(dá)水平,探討母胎界面免疫失衡在LM致小鼠流產(chǎn)中的作用,為臨床LM致流產(chǎn)的防治提供科學(xué)依據(jù).
LM菌株和小鼠巨噬細(xì)胞系B6分別由Kyoto大學(xué)醫(yī)學(xué)研究科Masao Mitsuyama博士和Massachusetts大學(xué)醫(yī)學(xué)院Katherine Fitzgerald教授惠贈(zèng),ICR小鼠購自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.
小鼠IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10 ELISA 試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品;細(xì)菌培養(yǎng)所用的瓊脂和胰蛋白胨分別是Sigma和Oxoid公司產(chǎn)品;脫水牛心浸粉和腦浸粉為北京奧博星公司產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)所用的DMEM培養(yǎng)基購自Gibco BRL公司;胎牛血清為索萊寶公司產(chǎn)品.
挑選6周齡發(fā)情母鼠與正常公鼠1∶1合籠,次日清晨挑取妊娠小鼠隨機(jī)分組,每組8只,共7組,其中6個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組,妊娠第6.5天,對(duì)照組尾靜脈注射0.2 mL磷酸鹽緩沖液,實(shí)驗(yàn)組分別尾靜脈注射0.2 mL的LM/WT或ΔhlyLM 菌懸液,最終注射劑量為5×104、5×105、5×106CFU/只,分別代表低、中、高3種不同劑量. 3 d后小鼠頸椎脫臼處死,解剖后統(tǒng)計(jì)小鼠胚胎存活率,取子宮角加入到組織裂解液中裂解,離心取上清液用于細(xì)胞因子的檢測(cè).
將小鼠巨噬細(xì)胞B6接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,分成3組:對(duì)照組、LM/WT感染組和ΔhlyLM 感染組,對(duì)照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基,2個(gè)感染組分別加入含LM/WT或ΔhlyLM的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(2種LM與細(xì)胞的感染比均為40∶1),在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min,再用含50 μg/mL慶大霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h以殺死細(xì)胞外的細(xì)菌,最后用V-15培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,收集培養(yǎng)基,離心取上清液用于細(xì)胞因子的檢測(cè).
按下列公式計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的胚胎存活率:
胚胎存活率=正常胚胎數(shù)/(被吸收的胚胎數(shù)+正常胚胎數(shù))×100%.
采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒對(duì)子宮組織和巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子進(jìn)行測(cè)定:按照試劑盒說明書操作,反應(yīng)終止后,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上讀取450 nm波長下的OD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各種細(xì)胞因子的含量.
使用SPSS17.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.
LM/WT和ΔhlyLM感染妊娠小鼠后統(tǒng)計(jì)小鼠胚胎存活率,結(jié)果如圖1所示.與對(duì)照組相比,LM/WT感染組小鼠胚胎存活率顯著下降,并且隨著感染劑量的增加胚胎存活率降低;ΔhlyLM感染組與對(duì)照組相比,高、中、低劑量組胚胎存活率均沒有明顯變化,說明LM可誘導(dǎo)小鼠流產(chǎn)的發(fā)生,并且LLO在其中發(fā)揮著重要的作用.
*代表與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05);**代表與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01);代表感染劑量由低到高依次為低、中、高劑量組.
為探討LM誘導(dǎo)的小鼠流產(chǎn)是否與母胎界面Th1和Th2細(xì)胞因子失衡有關(guān),檢測(cè)了LM/WT和ΔhlyLM感染后小鼠子宮組織中主要Th1和Th2細(xì)胞因子水平. Th1細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2),無論是高劑量還是低劑量LM/WT感染的妊娠小鼠,子宮組織中IL-2和IFN-γ水平都顯著高于對(duì)照組(P<0.05),并且與感染劑量呈正相關(guān),而ΔhlyLM感染妊娠小鼠后,與對(duì)照組相比,各個(gè)感染組子宮中IFN-γ和IL-2含量無顯著差異(P>0.05),即LM/WT在誘導(dǎo)妊娠小鼠流產(chǎn)的同時(shí)也誘導(dǎo)了子宮中IFN-γ和IL-2含量的增加,ΔhlyLM沒有誘導(dǎo)妊娠小鼠流產(chǎn)的同時(shí)也沒有誘導(dǎo)子宮中IFN-γ和IL-2含量的增加,說明LM誘導(dǎo)的小鼠流產(chǎn)與其誘導(dǎo)的母胎界面Th1細(xì)胞因子增加相關(guān),而LLO在其中發(fā)揮著重要作用.
*代表與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05);代表感染劑量由低到高依次為低、中、高劑量組.
Th2細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3),與對(duì)照組相比,無論是感染LM/WT還是ΔhlyLM后的小鼠子宮中IL-4水平均升高而IL-10水平均降低,但是差異都不顯著(P>0.05),說明LM/WT和ΔhlyLM感染均沒有誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子(IL-4,IL-10)發(fā)生顯著變化.
代表感染劑量由低到高依次為低、中、高劑量組.
巨噬細(xì)胞是母胎界面主要的免疫細(xì)胞,為了檢測(cè)巨噬細(xì)胞是否參與了母胎界面Th1和Th2型細(xì)胞因子的變化,用LM感染小鼠巨噬細(xì)胞B6后,ELISA檢測(cè)培養(yǎng)基中Th1和Th2細(xì)胞因子的水平.
Th1型細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4a,b),LM/WT感染組培養(yǎng)基中IL-2和IFN-γ的水平都高于對(duì)照組,且差異極顯著(P<0.01);ΔhlyLM感染組和對(duì)照組相比沒有顯著差異.Th2細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4 c,d),與對(duì)照組相比,LM/WT感染組培養(yǎng)基中IL-4水平明顯升高(P<0.05),IL-10的水平明顯降低(P<0.05);ΔhlyLM感染組培養(yǎng)基中IL-4和IL-10水平與對(duì)照組相比沒有明顯變化.
*代表差異顯著(P<0.05);** 代表差異極顯著(P<0.01);NS代表無顯著性差異(P>0.05).
LM感染可引發(fā)人和動(dòng)物流產(chǎn),其對(duì)人類生殖健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)的影響不容忽視,但LM致流產(chǎn)的機(jī)制尚不清楚.妊娠過程中母胎界面Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡是維持妊娠正常進(jìn)行的保證,Th1/Th2細(xì)胞因子失衡是妊娠失敗的一個(gè)重要原因[6-8].因此,本研究通過分析LM感染后妊娠小鼠胚胎存活率與子宮中Th1和Th2細(xì)胞因子的相關(guān)性探討了Th1和Th2細(xì)胞因子的變化在LM致流產(chǎn)中的作用.
LM感染妊娠動(dòng)物后個(gè)別Th1或Th2細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生變化已有一些報(bào)道[9-11],但是多種Th1和Th2細(xì)胞因子綜合在一起進(jìn)行免疫動(dòng)態(tài)平衡的分析還未見報(bào)道,因此本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)LM誘導(dǎo)的流產(chǎn)小鼠子宮中4種有代表性的Th1和Th2細(xì)胞因子水平綜合來探討Th1/Th2細(xì)胞因子平衡與妊娠的關(guān)系.結(jié)果表明,LM感染妊娠小鼠誘導(dǎo)了流產(chǎn)小鼠母胎界面主要Th1細(xì)胞因子水平的升高,從而誘導(dǎo)Thl與Th2型細(xì)胞因子的平衡偏向Th1型,過量的 Th1 型細(xì)胞因子一方面降低保護(hù)性的Th1抗胞內(nèi)感染的應(yīng)答,導(dǎo)致感染不愈,另一方面進(jìn)一步激活NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,使其產(chǎn)生更多的 Th1 型細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì),加重對(duì)胚胎的傷害,從而危及妊娠[5,7-8].
在妊娠過程中,母胎界面的巨噬細(xì)胞作為一種免疫細(xì)胞參與妊娠的建立和維持局部免疫反應(yīng),在整個(gè)妊娠中維持較高水平,在妊娠早期占子宮蛻膜免疫細(xì)胞總數(shù)的30%~35%,并且隨著妊娠的發(fā)展逐漸增加[12],推測(cè)它分泌的細(xì)胞因子與其他免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子一起影響著妊娠結(jié)果.因此,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,檢測(cè)了LM感染對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌的Thl和Th2型細(xì)胞因子水平的影響,結(jié)果顯示LM感染誘導(dǎo)了小鼠巨噬細(xì)胞的Thl型細(xì)胞因子水平明顯升高,使細(xì)胞外Thl/Th2細(xì)胞因子的平衡偏向Th1型,與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致,說明巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在LM誘導(dǎo)的母胎界面Th1/Th2細(xì)胞因子失衡中發(fā)揮著重要的作用.
已知LM在感染宿主細(xì)胞的過程中,毒力因子LLO發(fā)揮著重要的作用[13].為了驗(yàn)證LLO在LM致流產(chǎn)中的作用,分別用LM/WT和ΔhlyLM感染妊娠小鼠和巨噬細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),ΔhlyLM沒有誘導(dǎo)小鼠流產(chǎn)的發(fā)生,同時(shí)沒有改變母胎界面Thl/Th2型細(xì)胞因子的平衡,說明LLO在LM誘導(dǎo)流產(chǎn)小鼠母胎界面Thl/Th2細(xì)胞因子失衡過程中發(fā)揮著重要的作用.
綜上,LM通過LLO誘導(dǎo)的小鼠流產(chǎn)與母胎界面Th1/Th2細(xì)胞因子失衡相關(guān),其中巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平的改變?cè)谶@種失衡中發(fā)揮著重要的作用.