姜曉東，成永旭，潘建林，李曉東，吳旭干

(1.上海海洋大學農業(yè)農村部淡水種質資源重點實驗室，上海 201306；2.江蘇省淡水水產研究所，南京210017；3.盤錦光合蟹業(yè)有限公司，遼寧盤錦 124200；4.上海海洋大學水產動物遺傳育種上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306；5.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范心，上海 201306)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)簡稱河蟹，是我國主要的經(jīng)濟養(yǎng)殖蟹類[1]。雖然河蟹是中國的土著甲殼蟹類并廣泛分布于沿海諸省的各大水域，但在歐洲和北美洲等海外地區(qū)也有大量分布[2-3]。主要是由于20世紀初河蟹被偶然帶入德國，它們在海外大量繁殖并形成了數(shù)量龐大的種群，隨著分布范圍不斷擴大，現(xiàn)已遍及歐洲大陸和北美洲大陸各水系[4-5]。有關歐美大陸與中國各水系河蟹之間親緣關系，已有研究結果表明歐美地區(qū)河蟹與中國長江水系河蟹的親緣關系最為接近[6-8]。

由于常使用小規(guī)格親本近親繁殖以及不同水系間的盲目引種和雜交，我國長江流域河蟹種質退化嚴重，而歐美地區(qū)河蟹一直在相對封閉的環(huán)境下生長繁育，未受到人為影響和相近種群的基因污染，很好地保持了長江水系河蟹的優(yōu)良基因和生長特性[9-10]。中國長江水系與歐洲地區(qū)河蟹親緣關系接近但生長性狀差異明顯，如何通過形態(tài)特征鑒別兩群體河蟹顯得尤為重要。王武等[11]在通過聚類分析和判別分析探究中華絨螯蟹和日本絨螯蟹形態(tài)特征差異的研究中，曾以荷蘭境內萊茵河野生河蟹作為對照，而長江水系與歐洲地區(qū)河蟹形態(tài)特征之間的直接比較目前尚未見報道。近年來，隨著計算機圖像處理技術和統(tǒng)計學的發(fā)展，地標點幾何形態(tài)測量法在水生動物形態(tài)的研究中得到應用，其中以甲殼類和軟體動物為代表的無脊椎動和以魚類為代表的脊椎動物的研究最為廣泛[12-13]。然而，目前地標點法應用于河蟹種群鑒別的研究較少，僅見于區(qū)分長江水系不同產地的池塘養(yǎng)殖河蟹，而運用地標點法比較不同地理種群河蟹形態(tài)特征的研究鮮有報道[14]。為此，該研究以河蟹頭胸甲作為研究對象，探討地標點法對中國長江與荷蘭野生河蟹的鑒別效果，以期更全面地了解歐洲地區(qū)河蟹的形態(tài)特征，為歐洲地區(qū)河蟹的合理利用提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2018年分別于江蘇鎮(zhèn)江和荷蘭艾瑟爾湖的天然水域中采集野生河蟹，每一地理種群隨機采集性成熟且四肢健全的雌雄樣本各20只。為避免時間不同造成的操作誤差，所有野生河蟹運輸回實驗室后均暫保存于-40 ℃冰箱，待所有樣本采集齊全后統(tǒng)一處理。各水系河蟹的采集時間、采集地點以及平均體質量等信息如表1所示。

表1 長江與荷蘭河蟹樣品采集信息表Tab.1 Sampling information of wild E.sinensis from the Yangtze River and the Netherlands

1.2 測量方法

1.2.1 地標點的建立與提取

該研究以河蟹頭胸甲作為數(shù)據(jù)采集對象，采用單反相機(Nikon D300)在相同目鏡物鏡倍數(shù)下拍攝取得頭胸甲形態(tài)的二維影像。拍攝時鏡頭與樣品間的距離為30 cm左右，頭胸甲放置于成像區(qū)域的正中位置，使得鏡頭同樣與頭胸甲垂直。利用tpsDig2軟件在拍攝好的頭胸甲圖片上建立地標點(圖1)，獲取相應地標點的x、y坐標值并建立數(shù)據(jù)文件。由于河蟹形態(tài)特征表現(xiàn)為雌雄二態(tài)性，該研究中雌雄個體分開采點分析[15]。

圖1 河蟹頭胸甲的地標點位置圖Fig.1 Landmark locations on the carapace of E.sinensis

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

用tpsRelw軟件經(jīng)普氏疊加得出地標點的分布情況，對每個樣本的地標點進行平移置中、旋轉和縮放等處理去除非形狀差異并得到標準化數(shù)據(jù)，據(jù)此進行局部扭曲和相對扭曲主成分分析。保存軟件生成的相對扭曲得分(relative warps scores,RW)矩陣和分析報告，用于后續(xù)采用Bayes方法進行逐步判別分析，分析軟件為 SPSS 24.0。利用tpsRegr軟件進行薄板樣條分析，繪出各水系河蟹的網(wǎng)格變形圖，比較形態(tài)差異。

2 結果

2.1 兩群體的頭胸甲形態(tài)特征的主成分差異

相對扭曲主成分分析共提取了9個主成分，其中前2個主成分的累積貢獻率均超過50.00%(表2)，說明第一和第二主成分可以概括兩群體之間主要的形態(tài)特征差異。從第一和第二主成分繪制的散點圖(圖2)可以看出，無論雌體還是雄體，長江與荷蘭個體均完全分離且各自形成較為集中的區(qū)域。

表2 相對扭曲得分主成分的特征值與貢獻率Tab.2 Eigenvalues and contributions of the first three principal components of relative warps scores

2.2 兩群體頭胸甲邊緣額刺和側刺可視化差異

利用tpsRelw軟件根據(jù)地標點數(shù)據(jù)文件計算的平均形和重疊后的效果如圖3所示，通過tpsRegr軟件進行扭曲、回歸分析和置換檢驗后的網(wǎng)格圖如圖4所示。通過比較平均形與兩群體網(wǎng)格圖可以發(fā)現(xiàn)，兩群體之間存在差異的形態(tài)特征主要為頭胸甲邊緣額刺和側刺的位置。

2.3 區(qū)分兩群體的判別效果

利用SPSS進行逐步判別分析時，分別從雌雄個體的相對扭曲得分中篩選出對判別貢獻率較大的5個變量建立判別方程，用于兩群體河蟹的初步判別，判別方程系數(shù)見表3。逐步判別分析結果顯示，長江與荷蘭群體的各20只河蟹樣本中，雌雄蟹的判別準確率均為100%(表4)。因此，利用基于地標點法的幾何形態(tài)學測量可以有效判別兩群體野生絨螯蟹，且判別效果較好。

3 討論

3.1 地標點法的鑒別效果

本研究中基于地標點的幾何形態(tài)測量法在長江和荷蘭野生河蟹的區(qū)分中取得了較好的識別效果。判別分析中兩群體河蟹的判別準確率均為100%，而之前在比較中華絨螯蟹和日本絨螯蟹形態(tài)特征中，荷蘭境內萊茵河野生河蟹基于傳統(tǒng)形態(tài)測量法的判別準確率為92.80%[11]，稍低于本研究中基于地標點幾何形態(tài)測量法的判別準確率。此外，主成分散點圖中兩水系河蟹完全分離且各自形成較為集中的區(qū)域，并通過差異可視化分析發(fā)現(xiàn)了兩水系在額刺和側刺上的形狀差異，這些結果均說明地標點法可以將這兩群體河蟹有效區(qū)分。

圖2 長江和荷蘭野生河蟹形態(tài)特征的第一和第二主成分散點圖Fig.2 Scatter plots of PC1 and PC2 of wild E.sinensis from the Yangtze River and the Netherlands

圖3 長江和荷蘭野生河蟹頭胸甲的平均形(A)和疊加圖(B)Fig.3 Mean shape(A) and vectorization(B) of landmarks on carapace of wild E.sinensis from the Yangtze River and the Netherlands

圖4 長江和荷蘭野生河蟹頭胸甲的網(wǎng)格變形圖與變異可視化(變異擴大3倍)Fig.4 Grid deformation of wild E.sinensis from the Yangtze River and the Netherlands(variations were enlarged 3 times)a.雄體;b.雌體;1.YR群體;2.HL群體.

地標點法的鑒別優(yōu)勢主要在于可去除非形狀變異的干擾，將研究對象的形狀視為一個變量來進行比較，從而找出傳統(tǒng)形態(tài)測量中較難發(fā)現(xiàn)的形態(tài)差異特征[16]。除此之外，地標點還能夠以圖形化的方式直觀地再現(xiàn)形態(tài)差異，清晰展現(xiàn)導致形狀差異的主要性狀以及性狀變化的趨勢[17]。地標點法在其他水生動物上亦有較好的體現(xiàn)：Ponton[18]分別使用傳統(tǒng)測量法、傅里葉法和地標點法比較鑒別三種半棱屬(Encrasicholina)魚類和印度小公魚(Stolephorusindicus)的耳石形態(tài)特征差異，其結果表明，地標點幾何形態(tài)測量法對耳石的鑒別效果好于另外兩種方法，并可以展現(xiàn)出耳石在魚類生長過程中的變化趨勢；蘇杭[19]通過不同形態(tài)學測量方法對柔魚(Ommastrephesbartramii)和莖柔魚(Dosidicusgigas)的群體鑒別和差異性進行分析，研究發(fā)現(xiàn)，相對于傳統(tǒng)測量學法和傅立葉分析法，地標點法對不同頭足類具有更好的判別效果。

表3 長江和荷蘭野生河蟹的判別方程系數(shù)Tab.3 Discriminant function coefficients of wild E.sinensis from the Yangtze River and the Netherlands

表4 長江和荷蘭野生河蟹的判別分析結果Tab.4 Classification results of wild E.sinensis from the Yangtze River and the Netherlands

雖然本研究中地標點法對兩群體河蟹的識別效果好于之前的傳統(tǒng)測量方法，但該方法在取點過程中的不確定性和隨機性，很可能會影響識別效果。例如，馮波等[20]在運用傳統(tǒng)形態(tài)測量方法和地標點方法對廣東陽江和湛江兩個短吻鲾(Leiognathusbrevirostris)的形態(tài)特征進行分析比較的研究中，由于所選取地標點的位置或數(shù)量不當，傳統(tǒng)形態(tài)測量方法反而表現(xiàn)出較好的區(qū)分效果，由此可見，地標點法的應用效果很大程度上取決于取點的準確性。因此在選取地標點的過程中，既要盡量選取合適的地標點又要剔除無效地標點，在降低地標點間相關性的同時盡可能涵蓋研究對象的形態(tài)特征信息。

3.2 形態(tài)特征差異的原因

本研究結果不僅驗證了地標點法的鑒別效果，同時也發(fā)現(xiàn)兩群體頭胸甲之間明顯的形態(tài)特征差異。之前的研究表明不同地理條件下水生動物的形態(tài)差異與其棲息環(huán)境相適應，底質、水流、溫度和食物等環(huán)境因素均能產生如體形和行為等方面的差異[21]。本研究中兩群體河蟹所生存的長江與荷蘭艾瑟爾湖的環(huán)境條件各具特點，兩群體形態(tài)特征在生長過程中均產生了適應性變化，加之近一個世紀的地理隔離，從而形成明顯的形態(tài)特征差異。

絨螯蟹屬的種類區(qū)分和種群識別中，頭胸甲上額刺、側刺、疣突和凹槽等形態(tài)結構均為重要的分類依據(jù)[22-23]。本研究形態(tài)差異可視化分析中額刺和側刺的形態(tài)特征同樣差異較大，主要表現(xiàn)為長江群體的額刺和側刺長度稍長于荷蘭群體，而疣突和凹槽位點差異較小，這與之前研究中環(huán)境變化主要影響甲殼動物頭胸甲額刺和側刺長度以及疣突和凹槽明顯程度的結論相一致[24]。在之前形態(tài)可塑性的研究中，美洲藍蟹(Callinectessapidus)在含有敵害生物的環(huán)境中蛻殼數(shù)次后側刺長度顯著增加，體現(xiàn)出甲殼動物側刺在野外環(huán)境中抵御敵害的功能，此外，不同水系野生河蟹移至池塘并人工養(yǎng)殖一代后形態(tài)特征趨于一致，因此該實驗中兩群體間的形態(tài)差異還可能與其所屬水域的生物資源特性有關[25-26]。與側刺相比，四肢作為河蟹接觸自然環(huán)境的直接部位，應當可以更充分地反映環(huán)境差異所導致的形態(tài)特征差異，但如何突破硬組織的限制而采集河蟹附肢等結構穩(wěn)定性較差部位的形態(tài)信息，仍需進一步嘗試。

綜上所述，地標點法能夠較為有效地揭示長江和荷蘭河蟹的形態(tài)特征差異，并可用于兩水域河蟹的群體識別，具有很好的應用前景。在下一步的研究中，需要增大樣本量、補充不同地理種群、篩選更合適的特征地標點，以期更全面地了解歐美地區(qū)河蟹的形態(tài)特征。