劉 飛，王 凡，李聰歌，馬雅雯，朱榮帥，黃瓊波

(洛陽師范學院，河南洛陽 471934)

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)于1959年引進國內，因其刺少肉多、味道鮮美、營養(yǎng)價值高、適應性較廣、生產經濟效益好等眾多優(yōu)點，其養(yǎng)殖規(guī)模迅猛發(fā)展，現(xiàn)已成為我國重要的冷水性經濟魚類。近年來，隨著人民生活水平和對優(yōu)質魚肉蛋白需求的日益提高，鱒魚養(yǎng)殖產量在2017年已達到4.146萬噸[1]，但仍存在很大的需求缺口。為應對大規(guī)模高密度養(yǎng)殖很可能帶來的病害頻發(fā)問題，開發(fā)綠色安全的魚類保健飼料成為有效的重要途徑。中草藥具有高效、低毒、低殘留等優(yōu)點，作為飼料添加劑在水產動物病害防治中具有廣闊的應用前景[2-3]。

紅棗又名大棗，其味甘香甜，風味獨特，不僅富含維生素C和多種礦物質等營養(yǎng)物質，還含有大棗多糖、大棗皂苷、環(huán)磷酸腺苷、蘆丁等多種生物活性物質，具有調節(jié)免疫力、抗氧化等多樣化功效[4-6]，是藥食兼用的佳品。近些年來，關于紅棗提升機體免疫能力的研究報道較多，有研究表明大棗多糖能夠刺激哺乳動物機體免疫器官，促進免疫細胞增殖分化，提高機體的特異性及其非特異性免疫效應[7-10]；而關于紅棗直接應用于經濟養(yǎng)殖動物飼料以增強其機體免疫力的研究報道很少見[11]。本試驗以虹鱒為試驗對象，研究紅棗提取物飼料添加對虹鱒幼魚血清生化指標和頭腎免疫相關基因表達的影響，以探討紅棗提取物作為魚類飼料促免疫功能添加劑的可能性，從而為虹鱒健康綠色飼料研發(fā)和紅棗的應用領域拓展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用虹鱒幼魚購自四川省眉山市東坡區(qū)天貴水產養(yǎng)殖場，體形正常，無病無畸形。暫養(yǎng)于冷水魚循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的飼養(yǎng)缸(直徑1 m×高1 m)中備用。參考紅棗在其他動物飼料中的適宜添加量[11]，同時考慮虹鱒的食性及其飼料適口性，選用紅棗20∶1提取物作為試驗飼料添加劑，其購自陜西森弗天然制品有限公司。

1.2 飼料制作

設計以魚粉和豆粕為蛋白源，豆油和魚油為脂肪源的虹鱒基礎飼料配方(見表1)，分別添加0%、0.25%、0.5%、1%紅棗提取物配置成4種試驗飼料，其中0%為對照組飼料。飼料原料按比例稱重、粉碎、混勻、加水后使用ZL-600顆粒機制得顆粒飼料，經24 h風干后裝入密封袋中，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 虹鱒基礎飼料配方Tab.1 Formula of rainbow trout basic feed

注：飼料原料購自中糧飼料(新沂)有限公司，預混料包括虹鱒所需的維生素和礦物質。

1.3 試驗設計

暫養(yǎng)14 d后，試驗分組前停食24 h，選取大小基本一致(體長7.2～8.4 cm)、生長狀態(tài)良好的虹鱒幼魚隨機分成4組，分別投喂添加0%(對照組)、0.25%、0.50%、1.00%紅棗提取物的4種試驗飼料，試驗養(yǎng)殖期為56 d，每組設置3個平行缸，每缸30尾。每天分3次按體重2%～5%進行定時定點飽食投喂。全天使用氧氣泵增氧和水體循環(huán)過濾、每天及時清理殘餌殘渣、清洗濾材和適量換水，以保持溶氧充足和水質良好。飼養(yǎng)期間水溫為11～15 ℃，pH 7.0±0.2，DO>8 mg/L。

養(yǎng)殖試驗結束，停食24 h后，每個試驗組隨機取18尾，測量體長、體重，魚體酒精棉消毒后，尾靜脈采集血液于離心管中，室溫放置1 h，4 ℃過夜后，3 500 r/min離心15 min，制取血清，每三尾魚為一個混合樣(共6個樣品)保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r試驗魚取血后在冰上進行解剖，取頭腎放入無RNA酶離心管中。所取樣品置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清生化指標的測定

谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)、溶菌酶(LZM)活性、酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)活性、以及尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、總蛋白(TP)、補體4(C4)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素6(IL-6)含量等血清指標均按照相應試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行測定。超氧化物歧化酶(SOD)采用WST-8法進行測定，其試劑盒購自碧云天生物技術公司。

1.5 頭腎免疫相關基因表達測定

從-80 ℃冰箱中隨機選取5個先前保存?zhèn)溆玫暮琪V頭腎組織，采用總RNA 極速提取試劑盒(上海飛捷生物技術有限公司)提取RNA。采用東洋紡生物科技有限公司試劑盒進行反轉錄。將反轉錄后得到的各樣本的cDNA、目的基因和內參基因(EF1 alpha)的上下游引物[12-13](見表2，華大基因合成)，按照Bestar SYBR Green qPCR MasterMix(德國DBI公司)說明書步驟制備20 μL的實時熒光定量PCR反應體系，然后放入實時熒光定量PCR儀(美國伯樂)中進行擴增。反應程序為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 cycles；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～98 ℃(10 s/cycle，0.5 ℃/cycle)。熒光定量PCR結束之后提取各基因的Cq值，并用2-ΔΔt法計算目的基因的相對表達結果。

表2 實時熒光定量PCR引物序列Tab.2 Gene primers used for real-time PCR

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用EXCEL2016進行整理，采用SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，各指標數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，采用LSD法來分析各濃度處理組與對照組之間的差異顯著性，P<0.05為存在顯著差異，P<0.01為極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 紅棗提取物對虹鱒肝腎功能的影響

各試驗組GPT和GOT活性、BUN和CREA含量檢測結果見表3。從表中可看出，除0.25%紅棗提取物組的GOT活性相對于對照組有增加外，其他所有三個濃度的紅棗提取物添加組在這4個指標上均相對于對照組呈現(xiàn)下降趨勢。其中，與對照組相比，CREA含量和BUN含量三個濃度組均出現(xiàn)極顯著下降；GPT活性在0.50%和1.00%紅棗提取物組極顯著下降；GOT活性也在0.50%和1.00%紅棗提取物組出現(xiàn)一定程度的下降，但無顯著差異。

表3 紅棗提取物對虹鱒肝腎功能血清指標的影響Tab.3 Effects of jujube extracts on liver and kidney function indexes in serum of O.mykiss

注：*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，下同。

2.2 紅棗提取物對虹鱒血清免疫指標的影響

各試驗組虹鱒血清中與免疫相關的8個指標的測定結果見表4。從表中可以看出，與對照組相比，ACP和AKP活性在三個添加紅棗提取物試驗組基本均有下降趨勢(僅0.25%紅棗提取物組ACP略有上升)，但均無顯著差異。而其他的6個指標在三個添加紅棗提取物試驗組幾乎均呈現(xiàn)增加趨勢(除IL-6含量在1.00%紅棗提取物組略有下降外)，并且TP含量在0.25%紅棗提取物組出現(xiàn)顯著增加；LZM活性均顯著高于對照組；SOD活性在0.50%紅棗提取物組極顯著增加；C4含量在0.25%和0.5%紅棗提取物組均極顯著增加；IL-6含量在0.25%紅棗提取物組顯著增加；TNF-α含量在0.25%和0.5%紅棗提取物組也極顯著增加。

2.3 紅棗提取物對虹鱒頭腎免疫相關基因表達定量分析

SOD、CAT、C3、Factor H、IL-1β和LZM等基因在不同紅棗提取物濃度試驗組的表達情況如下(圖1)。與對照組相比，SOD、CAT、C3、Factor H、IL-1β和LSZ等基因表達量除CAT和LZM基因在0.25%紅棗提取物組略有下調外，其他都呈現(xiàn)上調趨勢。所得數(shù)據(jù)在進行單因素方差分析后，多重比較結果表明：與對照組(0%紅棗提取物組)相比，SOD、IL-1β和C3基因在0.50%和1.00%紅棗提取物組均為顯著或極顯著上調；Factor H基因在0.50%紅棗提取物組呈顯著上調；其他試驗組各基因表達量雖也有一定上調趨勢，但均不顯著?？傮w而言，在這六個基因中，僅CAT和LZM基因未在紅棗提取物添加組出現(xiàn)顯著性上調。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

3.1 紅棗提取物添加對虹鱒幼魚血清生化指標的影響

血清生化指標水平能夠多角度地反映機體的健康和營養(yǎng)狀況。作為肝腎功能的重要血清指標，BUN和CREA含量能反相關地反映機體腎臟腎小球的濾過功能，而GPT和GOT活性能正相關地反映肝臟受損害的程度。本研究中，除0.25%紅棗提取物組的GOT活性相對于對照組有增加外，其他所有三個濃度的紅棗提取物添加組在這4個指標上均相對于對照組呈現(xiàn)下降趨勢，且大多數(shù)組的多個指標均有極顯著下降(詳見表3)，這說明紅棗提取物添加不僅能較大程度地提高機體腎功能，而且對肝臟有一定的保護作用，這對于屬于肉食性魚類的虹鱒保持健康狀況極為重要。董立軍等[14]研究表明紅棗濃縮汁能顯著減低血清中的BUN含量；馮鑫歡等[15]的組織學研究也表明紅棗水提物能有效保護糖尿病小鼠肝臟和腎臟，以減少損傷，這些均與本研究結果基本一致，均說明紅棗攝入能保護或改善動物體的肝腎組織及其功能。

血清蛋白具有維持滲透壓和pH、運輸、調節(jié)生理作用、免疫作用以及營養(yǎng)作用等多種生理功能，因此血清TP含量能間接反映機體的營養(yǎng)和免疫水平[16]。 AKP和ACP是機體維持正常生長和健康所必需的酶，其變化能夠在一定程度上反映吞噬細胞非特異性免疫能力的強弱[17]。本研究中血清ACP和AKP活性在紅棗提取物各組均與對照組相比無顯著差異，表明紅棗提取物添加不能顯著影響其吞噬細胞非特異性免疫能力。而紅棗提取物組的TP含量在三個紅棗提取物組均呈現(xiàn)增加趨勢，且相對于對照組TP含量在0.25%組顯著增加。這說明一定量的紅棗提取物能通過增加血清TP含量提高機體的營養(yǎng)和免疫水平。

3.2 紅棗提取物添加對虹鱒幼魚非特異性免疫能力的影響

LZM能專一性水解微生物細胞壁肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，從而溶解細菌和抑制微生物生長，具有增強機體免疫力的作用[18]。本試驗結果表明，血清中LZM活性三個紅棗提取物組均顯著提高，且頭腎其基因表達也在較高紅棗提取物添加量的兩個組呈現(xiàn)上調趨勢，這說明紅棗提取物添加能明顯增強LZM活性從而提高機體免疫力。常江等[19]的研究也表明紅棗注射液能使小鼠溶菌酶含量增加，這與本研究結果具有一致性。而作為生物抗氧化防御系統(tǒng)重要關鍵酶的SOD和CAT，前者是天然存在的超氧自由基清除因子，將其歧化為過氧化氫；而后者能催化過氧化氫分解為水和氧氣，從而最終避免細胞遭受氧化損傷。本研究結果中相對于對照組，0.50%組血清SOD活性極顯著增加，0.50%和1.00%組頭腎SOD基因表達極顯著上調,CAT基因表達也呈上調趨勢，這說明紅棗提取物添加能強化虹鱒機體的抗氧化防御系統(tǒng)功能。有研究表明，適宜的棗粉添加飼料能顯著提高蛋雞血清總抗氧化能力[10]；紅棗水提物能提高糖尿病小鼠肝臟的SOD活性及其抗氧化能力[9]；以西洋參提取物和紅棗提取物為原料制成復方制劑對小鼠連續(xù)灌胃能顯著提高其組織的SOD和CAT活性[20]。這些研究結果都說明紅棗提取物添加能提高動物機體的抗氧化能力，從而增強其非特異性免疫能力。

魚類補體系統(tǒng)是機體內最為復雜的限制性蛋白溶解系統(tǒng)，直接參與機體免疫防御，不論是在先天性免疫，還是獲得性免疫過程中都有著重要的作用。C3是補體系統(tǒng)的最關鍵成分，處于補體經典、凝集素和旁路三條激活途徑的匯聚點上；C4參與經典激活途徑，而Factor H是補體激活家族的調節(jié)劑的成員[21-23]。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，頭腎C3基因和Factor H基因的表達量，以及血清C4含量在三個紅棗提取物添加組均呈現(xiàn)增加趨勢，且在0.50%組均呈現(xiàn)顯著增加，而當添加濃度提高到1.00%時三個指標均有所回落。這說明紅棗提取物添加能通過提高虹鱒體內補體水平來增強機體免疫力。

細胞因子中的促炎性細胞因子是一類主要由免疫系統(tǒng)細胞生成的具有許多強大生物學效應的內源性多肽，可介導多種免疫反應，主要包括TNF-α、IL-1β和IL-6等[24-25]。在本試驗中相對于對照組,血清TNF-α含量在0.25%和0.50%組顯著增加，IL-6含量在0.25%組顯著增加，頭腎IL-1β基因在0.50%和1.00%組呈極顯著上調，這些說明紅棗提取物添加能激活虹鱒機體的免疫體系，增強其免疫能力。張慶[26]報道大棗中性多糖能夠促進小鼠腹腔巨噬細胞誘導分泌IL-1和TNF-α；姬玉潔[27]研究表明較高劑量的發(fā)酵冬棗粉能顯著提高小鼠血清IL-2、TNF-α含量，這些與本試驗研究結果基本一致。由此可見，適量的紅棗提取物添加能通過提高細胞因子水平來促進動物機體免疫能力增強。

4 小結

綜上，本試驗的研究結果發(fā)現(xiàn)，適量的紅棗提取物添加能起到顯著增強機體腎臟功能，保護肝臟的作用，同時能顯著提升血清LZM和SOD 活性，TP、C4 、IL-6和TNF-α的含量，以及顯著上調頭腎的C3、Factor H、IL-1β和SOD基因的mRNA表達量。