張洪超 薛張芝 徐曉蓉 丁 源 李和生 金 洋 王鴻飛 許 鳳

(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江寧波 315800)

烏賊(Sepia esculenta)屬海洋軟體動物,其肉質(zhì)營養(yǎng)豐富,含優(yōu)質(zhì)蛋白、多不飽和脂肪酸和多種人體必需的微量元素,是深受人們喜愛的海產(chǎn)佳品[1],曾為我國東海四大經(jīng)濟(jì)海產(chǎn)之一[2]。與其他海洋魚類相似,烏賊在保藏加工過程中由于脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化,使得必需氨基酸含量減少,導(dǎo)致蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值下降[3],最終影響烏賊肉品質(zhì)。

蛋白質(zhì)氧化的實(shí)質(zhì)是與脂肪氧化相似的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),自由基對敏感氨基酸和肽鏈進(jìn)行攻擊,引起蛋白質(zhì)主鏈的斷裂、氨基酸側(cè)鏈的修飾[4]和蛋白質(zhì)分子間的共價(jià)交聯(lián)[5-6],導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生聚合和片段化,使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵等是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要作用力[7],所以氧化改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的同時勢必改變其分子間相互作用力。因此,研究分子間作用力與結(jié)構(gòu)的變化,對探究蛋白質(zhì)氧化后性質(zhì)的變化具有重要意義。目前,蛋白氧化的研究多集中于蛋白高級結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出來的凝膠性、乳化性及持水性等表觀指標(biāo)方面[8]。研究表明,自由基主要氧化氨基酸含硫殘基和芳香族側(cè)鏈基團(tuán)[9]。有學(xué)者研究牛血清蛋白結(jié)構(gòu)及水合特性時發(fā)現(xiàn),蛋氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、組氨酸(His)和半胱氨酸(Cys)等最易受到自由基攻擊,經(jīng)氧化后含有芳香環(huán)的Tyr生成二酪氨酸,而含有巰基的Cys極易形成二硫鍵[10-11],其中二硫鍵和非二硫鍵是氧化體系中所有氧化后的肌球蛋白進(jìn)行交聯(lián)的主要化學(xué)鍵[8]。當(dāng)氨基酸殘基被破壞及修飾后,蛋白質(zhì)產(chǎn)生損傷,其理化性質(zhì)也會發(fā)生變化,Herrera等[12]研究虹鱒魚發(fā)現(xiàn)氧化不僅使蛋白質(zhì)分子構(gòu)象產(chǎn)生聚合,同時也使疏水作用、氫鍵和二硫鍵等發(fā)生改變,使蛋白質(zhì)分子失去原有的空間構(gòu)型,從而導(dǎo)致魚肉蛋白質(zhì)氧化變性。目前國內(nèi)外關(guān)于蛋白質(zhì)氧化的研究主要集中于禽肉蛋白、乳蛋白和魚蝦產(chǎn)品,而對烏賊蛋白質(zhì)氧化的研究較少。本試驗(yàn)選擇羥基自由基(·OH)氧化體系對烏賊肉進(jìn)行處理,探究不同氧化程度對烏賊肉蛋白質(zhì)分子間作用力、表面疏水性、巰基、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及烏賊肉結(jié)構(gòu)的變化情況,旨在探討蛋白質(zhì)氧化與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系,明確烏賊肉蛋白質(zhì)氧化的機(jī)理,為尋找最適烏賊貯藏保鮮的新型技術(shù)、減緩氧化速率、延長貯藏期、提高烏賊經(jīng)濟(jì)效益與食用品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金烏賊購于浙江舟山漁場,體長 21±3 cm,體重279±8.7 g,快速解剖沖洗,冰藏運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室備用。

牛血清蛋白,購于上海源葉生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國藥分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

5804R高速冷凍離心機(jī),德國 Eppendorf公司；XHF-D高速分散器,寧波新芝生物科技公司；721型可見分光光度計(jì),上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Jasco傅立葉紅外光譜儀,日本分光公司；KD-2850組織切片機(jī),金華科迪儀器設(shè)備；E-200光學(xué)顯微鏡,日本尼康公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 模擬烏賊肉氧化(·OH氧化)體系的建立與樣品制備 ·OH氧化體系的反應(yīng)過程:Vc+Fe3+→Fe2+,Fe2++H2O2→·OH。參照劉澤龍[13]的方法,并稍作修改。取1 cm×1 cm×1 cm的烏賊肉適量于氧化體系溶液中,反應(yīng)體系:0.01 mmol·L-1FeCl3,0.1 mmol·L-1Vc,H2O2濃度分別為 0、5、10、20、30、40 mmol·L-1,15 mmol·L-1哌嗪-N,N ’-雙(2-乙磺酸)[piperazine-N,N-bis(2-ethanesulfonic acid),PIPES],0.6 mol·L-1NaCl,pH值6.0。烏賊肉與氧化體系液質(zhì)量比為1∶5,4℃條件下氧化24 h后用1 mmol·L-1乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)終止反應(yīng),4℃貯藏備用。

1.3.2 分子間作用力測定 參照 Tan等[14]的方法,并稍作修改。取適量制備好的樣品,碾碎成糜狀,準(zhǔn)確稱取2 g烏賊肉糜加A1(10 mL 0.6 mol·L-1NaCl)提取液,8 000 r·min-1勻漿3 min,4℃放置1 h,取出并在4℃條件下10 000 r·min-1離心10 min,上清液于4℃保存。向A1處理所得沉淀中加入10 mL A2(1.5 mol·L-1尿素和 0.6 mol·L-1NaCl的混合液)溶液,重復(fù)上述操作,上清液于4℃保存。向A2處理所得沉淀中加入 10 mL A3(8 mol·L-1尿素和 0.6 mol·L-1NaCl的混合液)溶液,重復(fù)上述操作2次,將2次所得上清液混合后于4℃保存。向A3處理所得沉淀中加入10 mL A4(0.5 mol·L-1β-巰基乙醇、0.6 mol·L-1NaCl和8 mol·L-1尿素的混合液,pH值7.00溶液,重復(fù)勻漿與離心操作,所得上清液于4℃保存。向A4處理所得沉淀中加入1 mL 1 mol·L-1NaOH,4℃保存。將上述除A4外每步離心后所得上清液分別加入等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的三氯乙酸,10 000 r·min-1離心10 min,棄上清液,向沉淀中加入1 mL 1 mol·L-1NaOH溶液于4℃放置,采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量。溶解于A1的蛋白質(zhì)含量為離子鍵的貢獻(xiàn),溶解于A2的蛋白質(zhì)含量為氫鍵的貢獻(xiàn),溶解于A3的蛋白質(zhì)含量為疏水相互作用力的貢獻(xiàn),溶解于A4的蛋白質(zhì)含量為二硫鍵的貢獻(xiàn),A4溶液提取后沉淀的蛋白含量為非二硫共價(jià)鍵的貢獻(xiàn)。

1.3.3 肌原纖維蛋白提取 參考Xiong等[15]的方法,取2 g樣品,加入 20 mL 20 mmol·L-1Tris-maleate緩沖液(pH值7.0,含50 mmol·L-1KCl)后充分勻漿,4℃條件下10 000 r·min-1離心10 min,棄上清液后向沉淀中加入10 mL 20 mmol·L-1Tris-maleate緩沖液(pH值7.0,含0.6 mol·L-1KCl),充分勻漿后置于4℃冰箱中提取1 h,然后于4℃條件下10 000 r·min-1離心10 min,所得上清即為肌原纖維蛋白。

1.3.4 表面疏水性巰基的測定 參照Chelh等[16]的方法,以溴酚藍(lán)含量表示表面疏水性。取1 mL蛋白液加入200 μL 1 mg·mL-1溴酚藍(lán),對照組用1 mL磷酸鹽緩沖溶液代替蛋白液進(jìn)行測定。室溫條件下反應(yīng)10 min,4℃條件下 7 000 r·min-1離心15 min。 取1 mL上清液,稀釋10倍后,在595 nm波長處測定吸光度值。按照公式計(jì)算溴酚藍(lán)含量(μg):

式中,200為溴酚藍(lán)質(zhì)量,μg。

1.3.5 巰基和活性巰基測定 參考 Yongsawatdigul等[17]的方法,并稍作修改。取1 mL蛋白液于試管中,加入9 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖液1(pH值7.0,含8 mol·L-1尿素、0.6 mol·L-1KCl、10 mmol·L-1EDTA)。取上述混合液4.5 mL加入0.5 mL 0.1%2-硝基苯甲酸,40℃水浴30 min,在412 nm波長處測定吸光度值,即為總巰基的吸光度值?？瞻诪榫彌_液1。而活性巰基的測定用250 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液2(pH值7.0,含 0 mmol·L-1EDTA、0.6 mol·L-1KCl)替換緩沖液 1,混合液于4℃反應(yīng)1 h后,在412 nm波長處測定吸光度值?？瞻诪榫彌_液2。按照公式計(jì)算疏基含量:

式中,A表示412 nm波長處的吸光度值；n表示稀釋倍數(shù)；13 600 表示摩爾吸光系數(shù),L·mol-1·cm-1；ρ表示蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,mg·mL-1。

1.3.6 紅外光譜(infrared spectroscopy,FTIR)測定

將提取好的蛋白置入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48 h,取出后于干燥器中平衡2 h,在相對濕度20%條件下,取0.2 mg肌原纖維蛋白干粉和2 mg KBr在研缽中充分研磨,取適量進(jìn)行壓片,固定于樣品架上,采用傅立葉紅外光譜儀在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍進(jìn)行全波段掃描測定吸光度值,分析紅外光譜圖來確定氧化對烏賊肉蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響。

1.3.7 組織切片測定 參照Bahuaud等[18]的方法并稍作修改。取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm烏賊肉樣品于小試管中,用波恩氏液固定24 h,采用不同濃度的酒精進(jìn)行脫水透明,石蠟包埋,待蠟塊凝固后于切片機(jī)上進(jìn)行切片,將切好的組織固定在載玻片上進(jìn)行染色,待染色完成晾干用樹脂封片,干燥后在×100倍數(shù)顯微鏡下觀察拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用IBM SPSS Statistics 19.0對結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,Duncan多重檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)間的顯著性差異分析,采用Origin 8.5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ·OH氧化體系對烏賊肌原纖維蛋白分子間作用力的影響

2.1.1 離子鍵的變化 離子鍵是維持肌原纖維蛋白天然結(jié)構(gòu)的主要作用力,在外界因素(加熱、加壓、攪拌、輻照等)影響下,離子鍵被破壞從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)或四級結(jié)構(gòu)發(fā)生聚集及凝膠化[19]。由圖1可知,未處理(對照組)的烏賊肉肌原纖維蛋白離子鍵含量為28.60%；H2O2濃度為5 mmol·L-1時,離子鍵含量為27.54%,較對照組降低1.06個百分點(diǎn),無顯著性差異；20、30和40 mmol·L-1H2O2處理烏賊肉中離子鍵含量分別是25.49%、25.22%和24.78%,隨著H2O2濃度的增加,烏賊肉蛋白質(zhì)中離子鍵含量逐漸減少,H2O2濃度為40 mmol·L-1離子鍵較對照減少了3.82個百分點(diǎn),說明自由基對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)有一定的破壞。

2.1.2 氫鍵的變化 蛋白質(zhì)同一肽鏈的氨基和?；螂逆滈g可形成氫鍵,肽鏈因此呈現(xiàn)出規(guī)則構(gòu)象,如α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等二級結(jié)構(gòu)。由圖1可知,對照組氫鍵含量為31.04%,當(dāng)H2O2濃度為5 mmol·L-1時,烏賊肉中氫鍵含量為27.74%,與對照組相比差異顯著(P＜0.05)；H2O2濃度為 40 mmol·L-1時,氫鍵含量下降至16.66%,較對照組顯著降低了14.38個百分點(diǎn)(P＜0.05)。綜上表明,受自由基的影響,烏賊肉蛋白質(zhì)中氫鍵逐漸斷裂,且斷裂數(shù)量隨著自由基濃度的增加呈逐漸增多的趨勢。

2.1.3 疏水作用力的變化 由圖1可知,對照組烏賊肉中疏水作用力含量為29.90%,當(dāng)H2O2濃度為5 mmol·L-1時,疏水作用力含量為32.03%,與對照相比差異顯著(P＜0.05),20、30和 40 mmol·L-1H2O2處理烏賊肉中疏水作用力含量分別是34.94%、36.47%和37.97%,說明隨著·OH濃度的增加蛋白質(zhì)發(fā)生了變性,更多的疏水基團(tuán)暴露,顯著增強(qiáng)了疏水作用力。

2.1.4 二硫鍵的變化 由圖1可知,對照組烏賊肉中二硫鍵含量為5.86%,當(dāng)H2O2濃度為5、10 mmol·L-1時,二硫鍵含量較對照組顯著增加(P＜0.05),分別為7.94%和9.32%；當(dāng)H2O2濃度超過20 mmol·L-1時,二硫鍵生成的速率開始減慢,40 mmol·L-1H2O2處理的烏賊肉中二硫鍵含量為12.37%。

2.1.5 非二硫共價(jià)鍵的變化 由圖1可知,對照組烏賊肉中非二硫共價(jià)鍵含量為4.37%,當(dāng)H2O2濃度為5 mmol·L-1時,非二硫共價(jià)鍵含量為4.98%,與對照組無顯著性差異；40 mmol·L-1H2O2處理的烏賊肉中非二硫共價(jià)鍵含量8.24%,與對照組相比顯著增加3.87個百分點(diǎn)(P＜0.05)。

2.2 ·OH氧化體系對烏賊肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

由圖2可知,隨著H2O2濃度的增加,肌原纖維蛋白表面疏水性呈逐漸上升趨勢,對照組烏賊肉溴酚藍(lán)含量為 17.65 μg,當(dāng) H2O2濃度為 5 mmol·L-1時,溴酚藍(lán)含量為19.43 μg,與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)；但隨著H2O2濃度進(jìn)一步增加,表面疏水性呈顯著增加的趨勢,當(dāng)H2O2濃度為40 mmol·L-1時,溴酚藍(lán)含量達(dá)到39.55 μg。說明隨著·OH濃度增大,蛋白質(zhì)構(gòu)象更多地趨向于無序松散狀態(tài),一些疏水性脂肪族和芳香族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)從蛋白分子內(nèi)部暴露出來,導(dǎo)致疏水值增加[20],從而增加了蛋白質(zhì)的變性程度[16]。

圖2 ·OH氧化體系對烏賊肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effect of hydroxyl radical oxidation systems on surface hydrophobicity of Sepia esculenta myofibrillar protein

2.3 ·OH氧化體系對烏賊肌原纖維蛋白巰基含量的影響

由表1可知,隨著H2O2濃度的增加,總巰基與活性巰基含量均呈下降趨勢,當(dāng) H2O2濃度為 10 mmol·L-1時總巰基與活性巰基含量分別為25.00和20.42 nmol·mg-1,分別較對照組顯著下降24.49%和25.64%。當(dāng)H2O2濃度大于10 mmol·L-1時,巰基減少速率相對降低,但與對照組相比仍呈顯著性差異,這與二硫鍵生成速率保持一致。

表1 ·OH氧化體系對烏賊肌原纖維蛋白巰基含量的影響Table 1 Effect of hydroxyl radical oxidation systems on sulfhydryl content of Sepia esculenta myofibrillar protein

2.4 ·OH氧化體系氧化前后FTIR的變化

由圖3可知,酰胺A帶在3 392 cm-1處出現(xiàn)峰值,隨著H2O2濃度的增加其向高波數(shù)方向微微移動,3 392 cm-1處的峰主要是由N-H基團(tuán)變角震動產(chǎn)生,酰胺B帶在2 960 cm-1處的峰是因?yàn)镃-H伸縮振動引起的；1 642 cm-1處的峰對應(yīng)譜圖的酰胺Ⅰ帶,主要是C=O伸縮振動產(chǎn)生,能敏感地反映蛋白質(zhì)中二級結(jié)構(gòu)的變化[21],隨著H2O2濃度的增加酰胺Ⅰ帶峰位向低波數(shù)方向微微偏移,說明蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變；1 559 cm-1處出現(xiàn)的峰為酰胺Ⅱ帶特征光譜,隨著H2O2濃度的增加同樣向低波數(shù)方向微微移動,主要是由N-H鍵的彎曲振動引起；由C-N伸縮產(chǎn)生的酰胺Ⅲ帶的吸收峰出現(xiàn)在1 304 cm-1處,隨著H2O2濃度的增加其向高波數(shù)方向微微偏移。

2.5 ·OH氧化體系對烏賊肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

圖3 烏賊肌原纖維蛋白FTIR圖Fig.3 FTIR spectra of Sepia esculenta myofibrillar protein

研究表明,在蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶光譜圖中,峰在1 600～1 639 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)所占面積的百分含量為β-折疊結(jié)構(gòu),峰在1 640～1 650 cm-1波數(shù)范圍所占面積百分含量為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu),峰在1 651～1 660 cm-1波數(shù)范圍所占面積的百分含量為α-螺旋結(jié)構(gòu),峰在1 661～1 700 cm-1波數(shù)范圍所占面積的百分含量為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[22]。本研究利用PeakFit4.11軟件對FTIR的酰胺Ⅰ帶蛋白質(zhì)譜圖進(jìn)行傅里葉紅外自退卷積,求二階導(dǎo)數(shù)進(jìn)行高斯擬合,進(jìn)而將蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的譜峰分開進(jìn)行分析,結(jié)果如圖4所示。對照組中 α-螺旋和 β-折疊的含量分別為 27.99%和33.03%,占總比的61.02%；當(dāng)H2O2濃度為5 mmol·L-1時,α-螺旋和 β-折疊含量均降低,但降幅不明顯,而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量增加,分別為 27.87%和13.93%；隨著 H2O2濃度的逐漸升高,α-螺旋和 β-折疊含量分別降低至14.63%和14.15%,而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲分別增加了9.57和22.67個百分點(diǎn)。β-轉(zhuǎn)角增加量不多,可能是由于組成 β-轉(zhuǎn)角的脯氨酸(Pro)和甘氨酸(Gly)等氨基酸不易受到自由基的攻擊；無規(guī)則卷曲增加量較多則說明氨基酸經(jīng)自由基攻擊后,蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)的規(guī)律性被打亂,多肽鏈的空間走向發(fā)生重排。

圖4 ·OH氧化體系對烏賊肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of hydroxyl radical oxidation systems on secondary structure of Sepia esculenta myofibrillar protein

2.6 ·OH氧化體系對烏賊肉微觀結(jié)構(gòu)的影響

通過分析氧化前后烏賊肉的石蠟切片可知,對照組烏賊肉的肌纖維排列緊致有序,肌絲均勻密集,空隙較少(圖5-A)。 當(dāng) H2O2濃度低于10 mmol·L-1時,烏賊肉肌纖維的變化主要表現(xiàn)在胞間距增大,肌絲出現(xiàn)變細(xì)的跡象(圖5-B、C),這與氧化使肌原纖維蛋白間疏水作用和共價(jià)作用增加導(dǎo)致肌絲間接觸增強(qiáng)有關(guān)[13]。當(dāng)H2O2濃度高于10 mmol·L-1時,烏賊肉肌纖維蛋白細(xì)胞間距持續(xù)增大,結(jié)構(gòu)趨于疏松,肌絲變細(xì)程度加深,逐漸出現(xiàn)變形斷裂的現(xiàn)象,且濃度越大程度越深 (圖 5-D、E)。 當(dāng) H2O2濃度為 40 mmol·L-1時,烏賊肉肌纖維排列混亂,肌絲斷裂嚴(yán)重,卷曲明顯(圖5-F)。

圖5 ·OH氧化體系對烏賊肉微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of hydroxyl radical oxidation systems on microstructure of Sepia esculenta

3 討論

蛋白質(zhì)氧化是與脂肪氧化類似的電子轉(zhuǎn)移的鏈?zhǔn)椒磻?yīng),能改變蛋白質(zhì)帶電基團(tuán)間及基團(tuán)與水間的相互作用,從而打破分子間作用力的平衡并進(jìn)行重排。本研究發(fā)現(xiàn),隨著氧化體系中H2O2濃度的增加,離子鍵和氫鍵含量降低,說明氧化破壞了氨基酸并對其側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行了修飾。王策等[10]研究·OH氧化對牛血清蛋白的影響發(fā)現(xiàn)離子鍵含量從0.25降至0.10,這與本研究結(jié)果相似。一般情況下,相鄰蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)緊密結(jié)合,產(chǎn)生疏水相互作用力[23],疏水作用力的變化直接影響表面疏水性,表面疏水性越高,蛋白質(zhì)結(jié)合水分子的能力越弱,變性程度越大[24]。李學(xué)鵬等[25]研究丙烯醛氧化體系對大黃魚肌原纖維蛋白的影響時指出,氧化程度與肌原纖維蛋白表面疏水性的影響呈正相關(guān),說明氧化會促使蛋白質(zhì)變性,不斷增加表面疏水性。胡忠良等[26]和Liu等[27]也發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化會使蛋白質(zhì)表面疏水性增加,究其原因,可能是蛋白質(zhì)在氧化過程中,自由基攻擊氨基酸分子,使得蛋白質(zhì)緊密有序的結(jié)構(gòu)變得松散無序,將原來包埋的疏水基團(tuán)大量暴露在分子表面[28],從而增加了蛋白質(zhì)的表面疏水性。本研究中疏水作用力變化與表面疏水性變化的研究結(jié)果一致,說明氧化會導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化。

蛋白質(zhì)中所有氨基酸側(cè)鏈都易遭受自由基和非自由基的攻擊,其中Cys是最易受到影響的氨基酸殘基。當(dāng)自由基攻擊Cys時,其反應(yīng)活性巰基發(fā)生氧化形成二硫鍵[8]。本研究發(fā)現(xiàn)烏賊肉經(jīng)氧化后,總巰基與活性巰基均降低,當(dāng) H2O2濃度大于 10 mmol·L-1時,巰基減少速率相對降低,這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是由于氧化開始時暴露在蛋白質(zhì)表面的Cys量相對較多,經(jīng)·OH攻擊巰基后迅速生成二硫鍵,隨著·OH濃度的增加,表面巰基消耗殆盡后,反應(yīng)需進(jìn)一步攻擊蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu),使得內(nèi)部巰基相繼暴露,然后再與·OH反應(yīng),因此速率減緩,這與Liu等[29]、Zhang等[30]的結(jié)論相同。李學(xué)鵬等[31]研究指出H2O2濃度超過5 mmol·L-1時,蛋白質(zhì)二硫鍵含量未出現(xiàn)明顯增長,可能是高濃度·OH氧化巰基時形成次磺酸基等多種氧化產(chǎn)物,隨著氧化程度的加劇,蛋白質(zhì)可能斷裂成小分子硫化物。二硫鍵與非二硫共價(jià)鍵是共價(jià)交聯(lián)過程中最重要的作用力,蛋白質(zhì)變性交聯(lián),直接影響蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)。周非白[32]研究表明,丙二醛氧化可誘導(dǎo)肌球蛋白分子間產(chǎn)生非二硫共價(jià)鍵交聯(lián),從而導(dǎo)致非二硫共價(jià)鍵含量升高,這與本研究結(jié)果一致。

FTIR可精確靈敏地分析在氧化過程中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。本研究結(jié)果表明,烏賊肉肌原纖維蛋白在中紅外區(qū)有明顯的特征光譜吸收帶,隨著H2O2濃度的增加,蛋白質(zhì)分子中,酰胺A帶向高波數(shù)方向移動,表明氫鍵減少,與本研究分子間作用力所得氫鍵含量減少相吻合。Sai等[33]也報(bào)道當(dāng)肽段中N-H基團(tuán)形成氫鍵時,峰位會向低波數(shù)方向移動。帶有NH-或NH2-的氨基酸殘基側(cè)鏈,易受到自由基攻擊,斷裂生成羰基衍生物[34]。本研究中,氧化后的烏賊肉蛋白FTIR圖顯示,隨著H2O2濃度的增加,酰胺B帶的峰總體向高波段微移,說明蛋白質(zhì)離子鍵受到了自由基氧化的影響,推測可能是由于肽鏈斷裂和電子轉(zhuǎn)移,更多的氨基酸殘基(如酪氨酸)形成含有NH3+基團(tuán)的離子鍵；位于酰胺Ⅰ帶的峰向低波段方向發(fā)生了微移,可能是芳香環(huán)骨架上的C=C鍵振動造成的[35],因?yàn)樽杂苫趸鞍踪|(zhì)的過程中,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸展開,使包裹在分子內(nèi)部的一些疏水性的芳香族和脂肪族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)逐漸暴露[21],從而導(dǎo)致C=C鍵振動的增加。本研究中,蛋白表面疏水性的增加,與疏水作用力增加保持一致,可能與氧化使得芳香族和脂肪族氨基酸數(shù)量的增多相關(guān)。本研究表明,隨著H2O2濃度的升高,肌原纖維蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生改變,推測可能是自由基攻擊氨基酸以及靜電相互作用改變,使得維持蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的作用力平衡被打破,致使復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)β-折疊、α-螺旋難以維持,從而更多的轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲這種簡單的形式。陳霞霞等[36]指出隨著氧化的進(jìn)行,α-螺旋含量減少,多肽鏈在空間走向上發(fā)生重排。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致,證明氧化過程中蛋白質(zhì)分子氫鍵發(fā)生了斷裂,二級結(jié)構(gòu)遭到破壞。氧化使得烏賊肉肌原纖維蛋白出現(xiàn)變性現(xiàn)象,變性可能是由于自由基攻擊氨基酸基團(tuán),致使肌原纖維蛋白的氨基酸單位受到破壞,打破了分子內(nèi)與分子間相互作用力的平衡,從而出現(xiàn)纖維斷裂肌絲交聯(lián)聚集、斷裂等現(xiàn)象。這與劉澤龍[13]得到的肌絲和肌纖維聚集的累積效應(yīng)致使細(xì)胞收縮、胞間隙增大的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

隨著氧化處理濃度的升高,肌原纖維蛋白分子間作用力平衡被打破,肌原纖維蛋白表面疏水性增加,巰基與活性巰基含量降低；FTIR光譜帶向不同波數(shù)方向有規(guī)律的移動,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)趨于疏松、細(xì)胞間距持續(xù)增大、肌絲變細(xì),氧化程度越高肌絲斷裂卷曲越多。因此,氧化后蛋白質(zhì)分子間作用力產(chǎn)生了交聯(lián)現(xiàn)象,蛋白理化性質(zhì)發(fā)生改變,烏賊肉品質(zhì)受到影響。本研究探究了烏賊肉蛋白質(zhì)氧化分子間作用力變化的機(jī)理,填補(bǔ)了前人對烏賊等頭足類水產(chǎn)品在此機(jī)理方面探究的空缺,為后期研究最適烏賊貯藏保鮮的新型技術(shù)、減緩氧化速率、提高烏賊經(jīng)濟(jì)效益與食用品質(zhì)提供了一定的理論依據(jù)。