李澤姣,崔巖山,蔡曉琳,王鵬飛
(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,北京 101408)
隨著全球工農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展,許多國(guó)家都面臨著嚴(yán)峻的鉻污染問(wèn)題[1]。鉻(Cr)及其化合物是金屬加工、皮革制造、電鍍等行業(yè)所必需的基本原料之一。這些涉Cr產(chǎn)業(yè)在作業(yè)過(guò)程中排放大量含鉻廢氣、廢水和廢渣,導(dǎo)致大氣、水體和土壤均不同程度地受到Cr的污染[2-3]。環(huán)境中Cr主要以Cr(III)和Cr(VI)兩種形態(tài)存在,其中Cr(VI)的毒性遠(yuǎn)高于Cr(III),約是Cr(III)毒性的100多倍[4-5]。同時(shí)Cr(VI)具有明顯的致畸、致癌、致突變等危害。雖然近年來(lái),國(guó)家嚴(yán)格管控產(chǎn)業(yè)“三廢”的排放并投入大量資源進(jìn)行污染治理,但是由于Cr污染具有長(zhǎng)期性、潛在性和隱蔽性等特點(diǎn),其污染問(wèn)題仍不容小覷。在土壤中,Cr可以通過(guò)植物富集作用,經(jīng)過(guò)食物鏈,最終可能累積到人體內(nèi),給人體造成嚴(yán)重危害[3, 6]。Cr污染會(huì)給動(dòng)植物和人體帶來(lái)很大的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和健康風(fēng)險(xiǎn)[7],因此Cr已經(jīng)成為許多國(guó)家和地區(qū)優(yōu)先控制的污染物之一[8]。
蚯蚓慢性和急性毒性實(shí)驗(yàn)是最早開發(fā)和最為成熟的研究生態(tài)毒性的方法之一[9]。目前,關(guān)于Cr(III)和Cr(VI)對(duì)蚯蚓的急性毒性影響研究居多[5, 10]。而在生態(tài)毒理研究中,許多研究者偏向采用新加入Cr的土壤模擬Cr污染, 利用蚯蚓作為指示生物進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[11-12]。然而重金屬在進(jìn)入土壤這個(gè)復(fù)雜介質(zhì)中后,其遷移轉(zhuǎn)化會(huì)受到多種多樣的物理和生化作用的影響,最后完成固-液分配以達(dá)到其吸附熱力學(xué)平衡,因此其生物有效性和毒性可能會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低[8, 13-14]。因此老化作用獲得的人工污染土壤的重金屬生物有效性或毒性與田間污染土壤的生物有效性或毒性之間存在較大的差異[15]。
蚯蚓在受到污染物脅迫時(shí),體內(nèi)會(huì)被誘發(fā)產(chǎn)生大量的活性自由基,這會(huì)造成膜脂脫脂或膜脂過(guò)氧化,進(jìn)而使其膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能受到損傷[16]。而蚯蚓體內(nèi)的抗氧化酶可以將蚯蚓體內(nèi)的活性自由基轉(zhuǎn)化為水和氧氣,從而維持生物體內(nèi)自由基的代謝平衡,進(jìn)而可以增強(qiáng)其對(duì)污染物的抵抗能力[17]。其體內(nèi)抗氧化酶主要包括:過(guò)氧化物酶 (POD)、氧化氫酶 (CAT)、超氧化物歧化酶 (SOD)等。目前多數(shù)關(guān)于蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶的研究都側(cè)重于土壤中不同重金屬對(duì)其活性的影響[18-19],但關(guān)于土壤種類和不同Cr(VI)含量老化土壤對(duì)蚯蚓抗氧化酶系的影響研究缺乏系統(tǒng)性。
本研究以赤子愛勝蚓為受試生物,選取黑龍江、山西、江蘇3個(gè)省份的土壤,并進(jìn)行不同Cr(VI)污染濃度的一定時(shí)間的老化。探究在不同土壤及不同Cr(VI)含量老化土壤中,赤子愛勝蚓受污染物脅迫后其體內(nèi)SOD、CAT和POD的活性變化。
實(shí)驗(yàn)所用的蚯蚓是赤子愛勝蚓,購(gòu)買自江蘇省句容市某蚯蚓養(yǎng)殖基地。新購(gòu)置的蚯蚓以牛糞作為飼養(yǎng)基質(zhì),于25 ℃、自然光照條件下進(jìn)行飼養(yǎng)和繁殖。受試對(duì)象的選擇標(biāo)準(zhǔn)是:500 mg左右、體色鮮亮、行為活躍、有明顯生殖環(huán)。
選取的黑龍江、江蘇和山西3種土壤的pH值之間有顯著差異,分別為5.8、7.4和8.4 (表1);同時(shí),有機(jī)質(zhì)含量也有顯著差異,其質(zhì)量比分別為54.7、22.6和21.6 g·kg-1。
表1 黑龍江、山西、江蘇土壤理化性質(zhì)Table 1 Properties of the tested soils from Heilongjiang, Shanxi, and Jiangsu Provinces
老化過(guò)程中,選擇7個(gè)組進(jìn)行,Cr(VI)添加量分別為0、10、20、30、50、70和140 mg·kg-1。先用K2Cr2O7配制成500 mg·kg-1的母液,然后將母液稀釋成所需各種質(zhì)量比的Cr(VI)溶液。然后量取50 mL的目標(biāo)Cr(VI)溶液分別加入到500 g的干燥土壤中,充分混勻。隨后用超純水將土壤濕度調(diào)節(jié)至田間持水量的70%。最后將配置好的土壤移入1 L的一次性塑料盒中,每個(gè)塑料盒用注射器均勻扎孔50個(gè)以保證其透氣性。同時(shí),每天定時(shí)向土壤中噴灑定量超純水以維持土壤濕度,老化40天。
將選取的受試蚯蚓分成10條一組,然后分別放于已老化土壤表面。待蚯蚓鉆入土壤中后,在土壤表面撒上5 g燕麥片作為蚯蚓的食物,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,每周添加1次燕麥,并噴灑適量超純水維持其濕度。然后將一次性塑料盒移入人工氣候箱中,并設(shè)置光暗比16 h∶8 h,光照強(qiáng)度600~1 000 lux、溫度25 ℃、濕度75%。每組設(shè)置4個(gè)平行。
抗氧化酶活性測(cè)定:選取第1、7、14、28天實(shí)驗(yàn)的蚯蚓各2條,將蚯蚓清腸后稱重,加入9倍蚯蚓的勻漿緩沖液(Tris 50 mmol·L-1,DTT 1 mmol·L-1,EDTA 1 mmol·L-1,蔗糖250 mmol·L-1,pH=7.6),快速將蚯蚓剪成數(shù)段。隨后移入勻漿器進(jìn)行勻漿,最后制成10%的組織勻漿液,于離心管中3 000 r·min-1離心10 min,提取上清液。以上操作均在4 ℃條件下進(jìn)行,樣品提取液需置于-20 ℃進(jìn)行冷凍保存用于測(cè)蛋白質(zhì)含量和抗氧化酶活性。
SOD、CAT、POD活性測(cè)定均采用上海茁彩生物科技有限公司的試劑盒,根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行操作。CAT活性的測(cè)定采用紫外分光光度法;SOD活性的測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法;POD活性采用可見光法[1]。
所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均采用SPSS 20.0、Sigma Plot 13.0和Excel 2016軟件進(jìn)行處理和分析。
表2 顯著性差異分析結(jié)果Table 2 Results of the significance analysis
注:*表示P<0.05,**表示P<0.01。
不同Cr(VI)含量對(duì)蚯蚓SOD活性影響差異極顯著(P<0.01) (圖1和表2)。SOD活性在不同土壤內(nèi)均呈現(xiàn)先逐漸上升然后緩慢下降最終趨于平緩的趨勢(shì)。由于Cr是生物必需的微量元素之一,在低Cr(VI)環(huán)境中,外源添加Cr(VI)可以補(bǔ)充赤子愛勝蚓體內(nèi)的缺失,從而促進(jìn)蚯蚓的生長(zhǎng)發(fā)育[21]。在高Cr(VI)污染土壤中,高濃度的Cr(VI)會(huì)引起蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)變性,同時(shí)會(huì)造成核酸、核蛋白沉淀,體內(nèi)酶系統(tǒng)也會(huì)受到干擾,最終導(dǎo)致蚯蚓中毒[22]。不同暴露時(shí)間對(duì)蚯蚓SOD活性影響差異極顯著(P<0.01)。蚯蚓暴露于黑龍江老化土壤初期(1周左右),其抗氧化酶活性變化差異不顯著。暴露1 d和7 d的蚯蚓體內(nèi)SOD活性隨Cr(VI)質(zhì)量比增大而逐漸增加隨后趨于平衡,平衡時(shí)SOD含量約為1 100 U·g-1,其活性大約為對(duì)照組活性的1.1倍。隨暴露時(shí)間增加至14 d (圖1(c)),SOD含量在Cr(VI)質(zhì)量比為50 mg·kg-1時(shí)出現(xiàn)顯著增加,為1 150 U·g-1左右,其活性大約為對(duì)照組的1.25倍。當(dāng)暴露28 d (圖1(d))時(shí),SOD含量降低至1 000 U·g-1左右,其活性與對(duì)照組中SOD活性無(wú)顯著差異。暴露初期時(shí),污染脅迫突然增加,蚯蚓會(huì)產(chǎn)生較多的SOD酶以應(yīng)對(duì)污染脅迫。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),蚯蚓體內(nèi)產(chǎn)生金屬螯合蛋白[23],從而減少了Cr(VI)的毒性。當(dāng)蚯蚓暴露于山西老化土壤時(shí),蚯蚓體內(nèi)的SOD活性趨于平衡。暴露期間,所有處理與對(duì)照組比較,均無(wú)顯著差異。這表明SOD對(duì)山西土壤中Cr(VI)不敏感,Cr(VI)質(zhì)量比低于140 mg·kg-1的老化土壤對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD沒有產(chǎn)生顯著影響。蚯蚓暴露于老化江蘇土壤1~7 d時(shí),蚯蚓體內(nèi)SOD活性隨Cr(VI)質(zhì)量比升高先呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。在Cr(VI)質(zhì)量比為30 mg·kg-1處理中SOD活性最高,其含量為1 400 U·g-1左右,隨后SOD活性降低,其含量為940 U·g-1左右,這大約為對(duì)照組的67.14%。然后SOD活性逐漸升高最終達(dá)到平衡,其含量為1 400 U·g-1左右,這一數(shù)值與對(duì)照組含量差異不顯著。SOD能在沒有小分子電子傳遞基質(zhì)的情況下,催化超氧離子自由基O2-·與H+發(fā)生歧化反應(yīng)生成過(guò)氧化氫與氧氣,從而清除O2-·[24]。但當(dāng)蚯蚓體內(nèi)O2-·含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)SOD的歧化能力時(shí),多種細(xì)胞功能被破壞,細(xì)胞生理代謝受到影響,從而導(dǎo)致SOD活力下降[25]。
赤子愛勝蚓體內(nèi)CAT活性在不同類型土壤中差異顯著 (P<0.05) (圖2和表2)。黑龍江土壤中CAT活性明顯低于山西和江蘇土壤中CAT活性,這一現(xiàn)象在暴露時(shí)間長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)組中更為明顯。暴露時(shí)間和Cr(VI)含量對(duì)CAT活性影響差異極顯著 (P<0.01) (圖2和表2)。黑龍江老化土中,當(dāng)蚯蚓暴露于老化土壤28 d (圖2(d))時(shí),蚯蚓體內(nèi)CAT活性逐漸趨于平衡,平衡含量為589 U·g-1左右,與對(duì)照組中無(wú)顯著差異。在1~28 d暴露期間,CAT活性沒有表現(xiàn)出顯著的變化,這說(shuō)明低于140 mg·kg-1的Cr(VI)老化土壤對(duì)CAT沒有產(chǎn)生顯著影響。在山西老化土中暴露1~28 d時(shí),蚯蚓體內(nèi)CAT基本隨土壤中Cr(VI)質(zhì)量比升高而逐漸升高。在50 mg·kg-1Cr(VI)老化的土壤實(shí)驗(yàn)組中,CAT活性達(dá)到最高,約為對(duì)照組的1.35倍;140 mg·kg-1實(shí)驗(yàn)組中CAT活性約為對(duì)照組的1.17倍。在江蘇老化土中,蚯蚓體內(nèi)的CAT活性基本處于穩(wěn)定狀態(tài)。暴露期間內(nèi),所有處理組與對(duì)照組比較,均無(wú)顯著差異。這表明CAT活性對(duì)老化土壤中Cr(VI)不敏感,低于140 mg·kg-1的Cr(VI)老化土壤對(duì)蚯蚓體內(nèi)CAT活性沒有產(chǎn)生顯著影響。
圖2 Cr(VI)對(duì)赤子愛勝蚓體內(nèi)CAT活性的影響Fig.2 Effect of Cr(VI) on CAT activity of E. fetida
赤子愛勝蚓體內(nèi)POD活性在不同類型土壤中差異極顯著 (P<0.01) (圖3和表2);在不同Cr(VI)含量土壤中差異顯著 (P<0.05),不同暴露時(shí)間對(duì)蚯蚓體內(nèi)POD活性影響差異極顯著 (P<0.01) (圖3和表2)。通過(guò)分析,在黑龍江土中,當(dāng)蚯蚓暴露于老化土壤中1~7 d時(shí),蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶活性差異不顯著。暴露1 d和7 d的蚯蚓體內(nèi)POD活性隨Cr(VI)質(zhì)量比增大而逐漸增加隨后趨于平衡,平衡時(shí)POD含量約為2 800 U·g-1,其活性大約為對(duì)照組活性的2.12倍。隨暴露時(shí)間增加至14 d (圖3(c)),POD在Cr(VI)質(zhì)量比為30 mg·kg-1時(shí)出現(xiàn)大幅度波動(dòng),其含量降為1 700 U·g-1左右,其活性大約為對(duì)照組活性的1.29倍。隨后,當(dāng)暴露時(shí)間為28 d (圖3(d))時(shí),POD含量逐漸增加為2 500 U·g-1,其活性大約為對(duì)照組中POD活性的2.03倍。
山西老化土中,當(dāng)蚯蚓暴露于老化土壤中1 d (圖3(a))時(shí),隨Cr(VI)質(zhì)量比增大,蚯蚓體內(nèi)POD活性逐漸增加,在Cr(VI)質(zhì)量比為50 mg·kg-1的實(shí)驗(yàn)組中,蚯蚓體內(nèi)POD含量大約為2 900 U·g-1,大約為對(duì)照組POD濃度的2.20倍,隨后蚯蚓體內(nèi)POD含量逐漸達(dá)到平衡。當(dāng)蚯蚓暴露于老化土壤中7 d時(shí),隨Cr(VI)質(zhì)量比增大,蚯蚓體內(nèi)POD活性逐漸增加,最終在Cr(VI)質(zhì)量比為70 mg·kg-1之后達(dá)到平衡,平衡含量為2 500 U·g-1左右。當(dāng)蚯蚓暴露于老化土壤中14 d (圖3(c))時(shí),隨Cr(VI)質(zhì)量比增大,蚯蚓體內(nèi)POD活性逐漸增加,最終在Cr(VI)質(zhì)量比為50 mg·kg-1之后達(dá)到平衡,平衡含量為2 600 U·g-1左右。當(dāng)蚯蚓暴露于老化土壤中28 d (圖3(d))時(shí),隨Cr(VI)質(zhì)量比增大,蚯蚓體內(nèi)POD活性呈現(xiàn)先上升后下降最終趨于平衡的狀態(tài),平衡狀態(tài)時(shí)POD活性大約為對(duì)照組的2.11倍。環(huán)境污染物誘發(fā)蚯蚓體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基[23, 26],隨后蚯蚓體內(nèi)產(chǎn)生大量的POD等抗氧化酶清除過(guò)多的自由基[27-28],以減輕污染物對(duì)生物體的損害。其中,H2O2在POD的作用下可以轉(zhuǎn)化為H2O和O2。
圖3 Cr(VI)對(duì)赤子愛勝蚓體內(nèi)POD活性的影響Fig.3 Effect of Cr(VI) on POD activity of E. fetida
圖3中,當(dāng)蚯蚓暴露于江蘇老化土壤1、7、14 d時(shí),總體上,蚯蚓體內(nèi)POD活性隨土壤中Cr(VI)質(zhì)量比升高呈現(xiàn)先升高后降低隨后逐漸平衡的趨勢(shì)。POD活性在Cr(VI)質(zhì)量比為20~30 mg·kg-1時(shí)最高,大約為3 300 U·g-1,是對(duì)照組的1.14倍。平衡時(shí)POD含量大約為2 800 U·g-1,與對(duì)照組相當(dāng),差異不顯著。而當(dāng)蚯蚓暴露于江蘇老化土壤28 d時(shí),在Cr(VI)質(zhì)量比為10 mg·kg-1實(shí)驗(yàn)組中,POD含量最低,為2 300 U·g-1左右,占對(duì)照組的79.3%。
1) SOD活性在不同類型土壤中差異顯著 (P<0.05);在不同Cr(VI)含量土壤中差異極顯著 (P<0.01);不同暴露時(shí)間內(nèi),其活性差異極顯著 (P<0.01)。由于黑龍江土壤理化性質(zhì)與山西、江蘇土壤的差異性,黑龍江老化土中SOD活性明顯低于其余兩種土中SOD活性。黑龍江老化土與江蘇老化土暴露過(guò)程中,暴露初期,SOD活性顯著升高,隨著暴露時(shí)間的延遲,其酶活均受到顯著抑制。
2) CAT活性在不同類型土壤中差異顯著(P<0.05),CAT活性在不同Cr(VI)含量和不同暴露時(shí)間中差異極顯著 (P<0.01)。CAT活性在山西老化土中隨暴露時(shí)間和Cr(VI)含量變化明顯。所以,此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以為山西鉻污染土壤的生物標(biāo)志物選擇提供依據(jù)。
3) POD活性在不同類型土壤中差異極顯著 (P<0.01);在不同Cr(VI)含量土壤中差異顯著 (P<0.05);在不同暴露時(shí)間的處理中差異極顯著 (P<0.01)。POD活性隨著暴露時(shí)間的延遲和Cr(VI)含量變化在3種土壤中均發(fā)生顯著變化。
中國(guó)科學(xué)院大學(xué)學(xué)報(bào)2020年1期