杜鳳君， 徐敦明*， 張志剛， 林玉萍， 林立毅，賴國銀， 趙海軍， 劉 舟， 王 娟， 呂美玲

(1.廈門海關(guān)技術(shù)中心，福建廈門 361026；2.廈門醫(yī)學(xué)院，福建廈門 361023；3.安捷倫科技(中國)有限公司，北京 100102)

生物堿是一類具有含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)的堿性物質(zhì)，他們具有高效的藥理作用和生理活性。臨床上，治療劑量的阿片類生物堿具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抑制腸蠕動的作用；馬錢子類生物堿具有治療四肢麻木、癰瘡腫毒、咽喉腫痛的功效；荷葉堿類生物堿具有清熱解毒、降脂減肥、止血散瘀等作用[1 - 2]。然而，許多生物堿毒性極強，攝入毫克量級即可對人體造成傷害，具有致命性毒性。過量誤食、誤服含有毒生物堿類食物、藥物將導(dǎo)致食物中毒或藥物成癮。例如，長期食用含阿片類生物堿的食物可產(chǎn)生成癮性，嚴(yán)重時會造成神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)損傷；過量服用馬錢子堿會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮、反射亢進，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)疲憊與麻痹而死亡，嚴(yán)重危害人體健康[3 - 4]。

蜂蜜是天然甜類物質(zhì)，由蜜蜂采集植物花蜜釀造，故而花蜜種類決定了蜂蜜的品質(zhì)。自然界中某些植物的花粉和花蜜中含有天然毒素的生物堿，比如吡咯里西啶生物堿和異喹咻類生物堿[5]。近年來，包括蜂產(chǎn)品在內(nèi)的多種食品中生物堿中毒事件時有發(fā)生[6 - 8]，但目前國內(nèi)對生物堿的研究并不多[9 - 10]。生物堿的測定方法主要有化學(xué)分析法、分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等方法[11]。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合了液相色譜高效的在線分離能力和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度，具有同時檢測多種不同性質(zhì)目標(biāo)物的能力，在藥物多殘留分析中顯示出越來越廣闊的應(yīng)用前景。火鍋底料中嗎啡、可待因、罌粟堿等阿片類生物堿可以采用QuEChERS法快速提取后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行準(zhǔn)確測定；蜂蜜中倒千里光堿、克氏千里光寧等吡咯啶類生物堿可以采用強陽離子型固相萃取柱進行富集和凈化，然后用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行定性和定量分析[9 - 10]?，F(xiàn)有的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法大多只適用于檢測化學(xué)性質(zhì)相近的一類生物堿[12 - 14]，對化學(xué)性質(zhì)差別巨大的多類生物堿同時檢測尚未建立有效的檢測方法。

本研究選取了結(jié)構(gòu)差異顯著，化學(xué)性質(zhì)懸殊的33種生物堿為研究對象，旨在建立蜂蜜中多種類多類型生物堿的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本方法操作簡易、檢出限低、靈敏度高、穩(wěn)定性好，可以快速、準(zhǔn)確地進行定性定量分析，從而為蜂蜜中有毒生物堿的安全評價提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀-6470三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Agilent公司)；漩渦混勻器(德國，IKA公司)；離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

33種生物堿標(biāo)準(zhǔn)品購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司，中英文名稱及CAS號詳見表1。甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Sigma-Aldrich公司)；實驗用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取33種生物堿標(biāo)準(zhǔn)品適量(精確至0.1 mg)，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制為1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃下避光保存。實驗時根據(jù)需要，梯度稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理準(zhǔn)確稱取5 g蜂蜜樣品于50 mL離心管中，加入5 mL水，200 μL氨水，10 mL乙腈，混勻。然后加入NaCl至飽和，渦旋2 min，離心，移出上層有機相。下層水相再加入10 mL乙腈，渦旋2 min，離心，合并上層有機相。氮吹至干，用0.05 mol/L HCl-甲醇=8∶2(V/V)定容至2 mL。在定容液中加入0.2 g PSA粉末，渦旋混勻1 min，以15 000 r/min離心3 min。上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，待測。

1.2.3 液相色譜-質(zhì)譜條件色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(50 mm×3.0 mm，1.8 μm；美國Agilent公司)，流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：甲醇。梯度洗脫程序：0.0～1.0 min，40%B;1.0～3.0 min,40%～60%B,3.0～5.0 min,60%～70%B;5.0～5.1 min,70%～90%B;5.10～10 min，90%～100%B;10.0～12.0 min，100%B；流速：0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10.0 μL。離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描方式；霧化氣溫度300 ℃，干燥氣流速8.0 L/min，霧化器壓力35 psi，鞘流氣溫度400 ℃，鞘流氣流速12.0 L/min，毛細(xì)管電壓3 500 V，噴嘴電壓500 V。33種生物堿的保留時間、定性離子、定量離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數(shù)見表1。

表1 33種生物堿的保留時間、定量離子、定性離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數(shù)

(續(xù)表1)

No. CompoundCAS No.Retention time(min)Precursorion(m/z)Production(m/z)Fragmentor(V)Collision energy(eV)15Protopine130-86-95.664354.4149.0,189.0?16029,4116Ephedrine hydrochloride50-98-67.491202.6127.1,144.1?11045,2117Pilocarpine hydrochloride54-71-76.271245.7189.0,216.0?34057,4918Retrorsine480-54-63.879352.441.2,67.2?14577,5319Senecionine130-01-86.290336.4292.1,320.0?16033,3320Monocrotaline315-22-03.425326.4193.9,120.0?12033,4021Scopolamine51-34-33.832303.8137.9,156.1?12023,1522Tetrahydropalmatine2934-97-65.729355.473.1,189.0?15030,3023Coptisine chloride6020-18-45.699356.8165.1,193.0?14525,4024Benzoylaconine466-24-07.253604.7554.3,105.0?20541,6125Sophoridine6882-68-43.429249.4131.1,149.2?19045,4126Evodiamine518-17-26.293304.4216.0,289.0?27065,3727Chelerythrine34316-15-98.967349.4219.1,305.1?15550,3028Colchicine64-86-88.039399.9309.9,358.1?13532,2229Strychnine57-24-94.072334.9156.1,184.1?13555,4430Pseudoephedrine hydrochloride345-78-83.948166.0133.0,148.1?8014,1031Camptothecin7689-3-48.913348.8249.0,305.0?13533,2532Antu86-88-47.490208.8186.0,144.1?13520,2033Atropine51-55-84.347290.093.0,124.1?13535,26

*quantitative ions.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

生物堿是一類具有含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)的堿性物質(zhì)，酸性條件下含氮結(jié)構(gòu)單元容易被質(zhì)子化，適合采用電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式進行測定。本文考察了水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈4種流動相的分離效果。實驗發(fā)現(xiàn)，乙腈對生物堿的洗脫能力比甲醇強，以乙腈為流動相時所有目標(biāo)物在3 min內(nèi)被全部洗脫，流動相的酸化與否不會造成出峰時間的變化。大多數(shù)生物堿在甲醇中的響應(yīng)大于乙腈中的響應(yīng)，鬼臼毒堿、10-羥基喜樹堿、茄堿、秋水仙堿、可的松、喜樹堿、安妥等在乙腈中響應(yīng)比在甲醇中的高；同時，水相使用甲酸酸化后，各目標(biāo)化合物峰都比使用未酸化的水相具有更高的響應(yīng)。生物堿標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液(50 μg/L)的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 33種生物堿標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液(50 μg/L)總離子流(TIC)色譜圖Fig.1 TIC chromatograms of 33 alkaloids standard solution

2.2 提取條件的選擇

生物堿具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，能溶于有機溶劑，與酸成鹽后能溶于水。根據(jù)生物堿的溶解特性及兩性結(jié)構(gòu)，本文考察了乙腈、乙醚、乙酸乙酯的提取效果。取三試管，分別稱取5 g蜂蜜，加入5 mL水，加入生物堿標(biāo)準(zhǔn)工作液0.5 mL，加入200 μL氨水，加入NaCl至飽和后，分別采用10 mL乙腈、乙醚、乙酸乙酯提取，渦旋混勻，5 000 r/min離心，取上清液過膜上機，不同提取溶劑回收率見圖2。圖2表明提取效率：乙腈>乙醚>乙酸乙酯，后續(xù)的研究采用乙腈作為提取溶劑。

圖2 不同提取液對33種生物堿回收率的影響Fig 2 Effect of extraction on the recoveries of 33 alkaloids*1-33：The serial number of compound is the same as Table 1.

2.3 凈化方法的選擇

本文考察了PSA粉末、C18粉末、MCX小柱、HLB小柱對樣品的凈化效果。稱取適量試樣4份，2份供基質(zhì)分散固相萃取(QuEChERS)凈化，2份供固相萃取小柱凈化。在樣品中加入50 μL生物堿標(biāo)準(zhǔn)中間液，混勻，加入NaCl至飽和，加入10 mL乙腈，渦旋，離心，取上清液。殘渣再加入10 mL乙腈，渦旋，離心，合并有機相，氮吹至干，用0.05 mol/L HCl-甲醇=8∶2(V/V)定容至2 mL。一份加入0.2 g PSA粉末，一份加入0.2 g C18粉末，渦旋，離心，過膜后，上機測定。一份過MCX小柱，一份過HLB小柱，洗脫液氮吹至干，用0.05 mol/L HCl-甲醇=8∶2(V/V)定容至2 mL。定容液過膜備測。樣品回收率見圖3。鹽酸麻黃堿、野百合堿、槐定堿、白屈菜紅堿、安托在4種凈化方式下回收率均小于50%，其余29種生物堿采用HLB小柱凈化的回收率最差；采用C18粉末凈化次烏頭堿、荷葉堿、鬼臼毒堿、烏頭堿、茄堿、苦參堿、喜樹堿回收率不佳；采用PSA粉末、MCX柱凈化各生物堿回收率水平相當(dāng)，回收率在60%～120%之間。從節(jié)約實驗時間、溶劑以及實驗成本角度考慮，本實驗采用PSA粉末進行凈化。

圖3 不同凈化方式對33種生物堿回收率的影響Fig.3 Effect of clean-up methods on the recoveries of 33 alkaloids*1-33：The serial number of compound is the same as Table 1.

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評價

基質(zhì)效應(yīng)是指在目標(biāo)物測試過程中，由于其他物質(zhì)的存在，造成目標(biāo)物離子化過程受到增強或抑制，從而影響方法的準(zhǔn)確度[17]。當(dāng)前基質(zhì)效應(yīng)的評價方法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法和相對響應(yīng)值法。本文采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法(基質(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)匹配溶液在線性范圍內(nèi)斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液在線性范圍內(nèi)斜率×100%)考察了生物堿在蜂蜜中的基質(zhì)效應(yīng)，用空白樣品提取液為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，使標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液具有相同的離子化條件。研究結(jié)果表明，喜樹堿、10-羥基喜樹堿、茄堿表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)(105%～110%)，其他目標(biāo)物在基質(zhì)中的都為基質(zhì)抑制效應(yīng)(60%～90%)，其中鬼臼毒素的基質(zhì)抑制效應(yīng)最為強烈(20%～60%)。

為了確保測定的準(zhǔn)確性，消除基質(zhì)干擾，本研究采用基體匹配法進行定量。用不含分析目標(biāo)物的蜂蜜樣品的提取液配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終得到33種生物堿的線性方程、相關(guān)系數(shù)，見表2。結(jié)果表明，在0.5～50 μg/L濃度范圍內(nèi)，33種生物堿均具有良好的線性關(guān)系。在蜂蜜基質(zhì)中添加33種生物堿，考察方法的檢出限(信噪比S/N=3)和定量限(信噪比S/N=10)，33種生物堿的檢出限為0.33～6.7 μg/kg，定量限為 1.0～20 μg/kg(表2)。

表2 33種生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5 方法的回收率和精密度

加標(biāo)回收和精密度實驗，添加2、4、20 μg/kg 3個濃度水平目標(biāo)物，重復(fù)6次測定，其平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。新烏頭堿、次烏頭堿、番木鱉堿、荷葉堿、鬼臼毒堿、烏頭堿、檳榔堿、毛果蕓香堿、鉤吻堿、毒扁豆堿、茄堿、D -四羥基藥根堿、去氫駱駝蓬堿、苦參堿、原阿片堿、鹽酸匹魯卡品、惹桌堿、千里光堿、東莨菪堿、延胡索乙素、鹽酸黃連堿、苯甲酰烏頭原堿、吳茱萸堿、秋水仙堿、士的寧、鹽酸偽麻黃堿、喜樹堿、阿托品28種生物堿回收率范圍為64.5%～100.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.7%～14.6%之間，方法回收率和精密度良好。鹽酸麻黃堿、野百合堿、槐定堿、白屈菜紅堿、安妥5種生物堿的回收率低，無法滿足相關(guān)技術(shù)要求，但可以做為定性分析。

表3 33種生物堿在蜂蜜中的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

(續(xù)表3)

No.CompoundRecovery(%)RSD(%)10Eserine81.8-96.77.511Solanine74.4-83.95.212Tetrahydrojatrorrhizine73.3-86.37.513Harmine72.7-90.110.314Matrine61.2-79.410.715Protopine74.4-94.211.016Ephedrine hydrochloride6.0-8.615.117Pilocarpine hydrochloride71.4-87.29.618Retrorsine68.8-89.611.119Senecionine68.7-91.113.520Monocrotaline11.9-18.67.421Scopolamine85.6-97.75.822Tetrahydropalmatine73.0-86.99.123Coptisine chloride77.3-91.711.624Benzoylaconine67.0-85.612.125Sophoridine18.7-25.7141.426Evodiamine68.2-89.112.427Chelerythrine5.5-13.410.628Colchicine81.4-98.69.829Strychnine83.0-91.14.130Pseudoephedrine hydrochloride68.8-85.59.331Camptothecin73.5-90.19.832Antu6.19-7.510.133Atropine86.3-93.73.6

2.6 實際樣品的檢測

根據(jù)本文建立的方法，對20個市售蜂蜜樣品中的生物堿進行測定。其中，6個樣品中檢出生物堿，6個樣品中檢出了野百合堿，有3個樣品還檢出千里光堿。由于本方法對野百合堿的回收率低，定量不準(zhǔn)確，但定性準(zhǔn)確，可判定6個樣品中含有野百合堿。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定蜂蜜中33種有毒生物堿的方法。在0.5～50 μg/L濃度范圍內(nèi)，33種生物堿均具有良好的線性關(guān)系，其檢出限分別在0.33～6.7 μg/kg和1.0～20 μg/kg范圍。對蜂蜜基質(zhì)中進行2、4、20 μg/kg 3水平的加標(biāo)回收試驗，經(jīng)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，33種生物堿中28種的回收率范圍為64.5%～100.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.7%～14.6%之間，方法回收率和精密度良好；5種的回收率低，無法滿足相關(guān)技術(shù)要求，只能定性分析。本方法操作簡單，靈敏度高，可以快速地進行定性和定量分析，從而為蜂蜜中有毒生物堿的安全評價提供依據(jù)。