王嘉禹， 趙美萍*

(北京大學化學與分子工程學院，北京 100871)

1 前言

在許多遺傳性疾病及其它由于基因缺陷或異常導致的疾病的前瞻性治療中，基因治療具有相當重要的意義[1]?；蛑委熗ㄟ^將外源遺傳物質直接導入人體內，或者通過上調(或下調)一些缺失(或有害)基因的活性[2]，糾正或補償基因異常導致的病理變化，從而達到治療效果。然而，利用相同的方法，運動員也可以提高某些特定蛋白質的內源性表達水平，以達到提高運動成績的目的[2 - 3]。這種以非治療目的，利用基因、遺傳物質轉移或利用正?；蚧蛐揎椉毎徽?shù)剡_到提高運動成績的效果的物質或者技術，被稱為基因興奮劑(Gene Doping)[4]?；蚺d奮劑的使用不但嚴重違背了競技體育精神，還可能對運動員身體造成嚴重損害。由于導入基因與生理基因的一致性，針對基因興奮劑的檢測相對于藥物興奮劑檢測而言更加困難。本文簡要介紹了基因興奮劑的潛在候選基因、導入途徑與載體和基因興奮劑的危害，重點評述了目前已有基因興奮劑檢測方法及其缺陷，并對基因興奮劑檢測領域未來急需解決的問題進行了討論。

2 基因興奮劑簡介

2.1 基因興奮劑潛在的候選基因

人類基因組中至少有一百個染色體位點與運動表現(xiàn)相關[5]，這些基因位點均有可能作為潛在的基因興奮劑目標。其中有些基因被視作基因興奮劑的最佳候選者，得到了廣泛研究[6]。這些目標基因表達的蛋白有促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)、胰島素樣生長因子-1(Insulin-like Growth Factors-1，IGF-1)、血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、人體生長激素(Human Growth Hormone，hGH)、肌肉生長抑制素(Myostatin)和過氧化物酶體增殖劑激活受體(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-δ，PPAR-δ)等[3,6]。表1列出了幾種重要的基因興奮劑候選者以及它們在人體中起到的作用[3,6]。

2.2 基因興奮劑的導入途徑與載體

與基因治療一樣，基因興奮劑操作中最為關鍵和最具挑戰(zhàn)性的步驟之一是將靶基因導入特定的宿主細胞中。這一過程可以通過體內(In vivo)注射法或體外(Ex vivo)培養(yǎng)法兩種方式進行，這兩種途徑如圖1所示。體內注射法是將重組了靶基因的基因載體直接通過肌肉注射的方式導入到機體的特定部位，這些

表1 潛在的基因興奮劑候選者及其性質

基因載體包括了一些病毒載體、質粒以及脂質體等。體外培養(yǎng)法則是先將重組的基因載體導入體外培養(yǎng)的宿主組織細胞中，隨后再將這些組織細胞轉移回宿主體內從而發(fā)揮作用[7]。與體外培養(yǎng)法相比，體內注射法操作相對簡便，基因轉導效率更高，且成本相對較低[6]。目前而言，體內注射法的應用更為普遍，也更加成功。但體內注射法也伴隨著存在免疫反應、難以控制基因整合和基因表達等缺點[3,8 - 9]。

圖1 基因興奮劑的兩種導入途徑[6 - 7]Fig.1 Two strategies of gene doping[6 - 7]

無論是體內途徑還是體外途徑，基因載體作為基因治療或基因興奮劑操作步驟中的一個重要工具，得到了非常深入的研究。病毒作為一種高度進化的生物機器，能夠高效地將遺傳物質導入細胞核中。研究人員據(jù)此開發(fā)了多種類型的帶有復制缺陷的病毒載體系統(tǒng)，并在臨床試驗中對它們的效率、特異性和安全性進行測試[10]。病毒載體可分為整合型病毒載體和非整合型病毒載體兩類[9]。其中，整合型病毒載體，如慢病毒(Lentivirus)等，在進入細胞后會將其基因組整合到宿主細胞的染色體上；而非整合型病毒載體，如單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)、腺病毒(Adenovirus)及腺相關病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)等，在進入細胞核后其基因組保持在宿主細胞的染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中[9]。近年來，重組AAV(Recombinant AAV，rAAV)和慢病毒載體系統(tǒng)在許多臨床試驗中表現(xiàn)出了優(yōu)越的轉導效率和安全性[11 - 12]。而對于非病毒載體而言，由于質粒或質粒-脂質體復合物等載體存在著轉導效率低、基因表達多變、易被降解或清除等缺點，限制了它們的應用[3,9]。不過，相比于病毒載體，非病毒載體具有低成本、低免疫原性、高裝載容量以及易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點[13]，有著較為廣闊的應用前景。

目前基因治療雖然已經(jīng)獲得了一定程度的進展，但也存在著一些尚未解決的問題。在解決這些問題之前，基因治療是無法在臨床上開展大規(guī)模的使用的。不幸的是，基因興奮劑由于其本身的非法屬性，在使用過程中不受安全法規(guī)的約束[14]，因此使用者會面臨著多種巨大的風險。首先，無論是使用的病毒載體還是通過基因興奮劑表達出的蛋白都有可能引發(fā)嚴重的免疫反應。1999年，一名18歲的患者在全身注射高免疫原性的腺病毒載體后，由于體內發(fā)生的對病毒載體的免疫應答而死于器官衰竭[9,15]。雖然改進后的病毒載體免疫原性較低，但通過外源基因表達出的蛋白質與天然蛋白之間微小的結構差異也可能引發(fā)病理反應，例如在動物實驗中對獼猴轉入外源EPO基因卻導致這些獼猴患上了自身免疫性貧血[16 - 17]。其次，在基因治療或基因興奮劑中，對外源基因表達的控制是非常困難的。蛋白質的過量表達或者是由于過量蛋白的積累所導致的毒性同樣都有危害性[3]。另外，雖然并非所有病毒載體都會進行基因整合，但對于采用整合型病毒載體進行的基因治療/基因興奮劑而言，基因整合有可能造成抑癌基因斷裂，也可能導致原癌基因形成，從而提高患癌的風險[3]。除上述提到的風險外，基因治療還存在著長期的或潛在的危害以及倫理道德上的爭議。

盡管基因興奮劑存在上述種種風險與局限，一些案例表明在競技體育運動員的團隊中有人準備使用制藥或生物技術發(fā)明[18]。目前尚未有證據(jù)表明有運動員采用了基因興奮劑來提高自己的運動成績。但隨著基因治療的進一步進展，用于基因興奮劑的基因治療方法可能會變得更有吸引力[9]。因此，在世界反興奮劑機構(World Anti-Doping Agency，WADA)將基因興奮劑列入禁止名單[4]的同時，在常規(guī)興奮劑檢測中增加可靠的、合法的、具有預防性質的基因興奮劑檢測項目也是至關重要的。

3 基因興奮劑的檢測方法

自1968年奧運會開始實施興奮劑檢測以來，已經(jīng)發(fā)展了大量的直接或間接檢測興奮劑和方法。直接檢測方法旨在鑒定尿液或血液等體液中的違禁物質及其代謝產(chǎn)物，而間接檢測方法的目標則是監(jiān)控服用或使用興奮劑后造成的一些生理變化，如表達差異、免疫反應及代謝變化等。通常而言，直接檢測法比間接檢測法更受青睞，但同時也存在著一些直接檢測法無法實施的情況，例如檢測與內源表達產(chǎn)物相同的物質，或某些由于代謝太快而無法檢測到的物質，此時就需要采用間接的方式進行檢測[3]。

相比于藥物興奮劑，基因興奮劑的檢測更為困難。這是由于基因興奮劑導入的外源基因與生理DNA的高度一致性，采用非侵入性的直接檢測方法難以進行鑒定[19]。而試圖檢測基因載體的間接檢測方法，即使能基于身體的免疫反應(例如對腺病毒或其它載體的免疫應答)進行檢測，常常也難以區(qū)分該免疫反應是源于自然感染還是人為導入的病毒[2]。不過近些年來研究人員也發(fā)展出了一系列直接或間接的檢測基因興奮劑的方法，以下將對一些代表性方法做簡要的介紹。

3.1 檢測外源基因表達的蛋白質

2004年，Lasne等[20]對獼猴通過肌肉注射了含有EPO cDNA(complementary DNA)的AAV載體后，發(fā)現(xiàn)病毒轉染前后獼猴血清中EPO蛋白同源異構體(Isoform)的等電聚焦圖譜發(fā)生改變。經(jīng)過分析，研究者認為這是由于不同細胞及組織表達的EPO蛋白糖基化水平不同所導致[20]。雖然能否將這一針對EPO基因興奮劑的檢測結果應用于人體仍處于假設階段，但對人體生長激素(hGH)同源異構體的檢測已經(jīng)能夠用于人類hGH基因興奮劑檢測。該方法基于對血漿中hGH兩種同源異構體(22 kDa與20 kDa)的定量檢測，如果基因興奮劑采用的是分子量為22 kDa的hGH，那么這兩種同源異構體的比例變化就能夠被檢測到[21]。不過這種比例變化相對于自然比例而言是否足夠明顯目前尚不清楚[9]。更重要的是，這種針對外源導入基因表達出的蛋白進行檢測的原理并不適用于所有的基因興奮劑候選蛋白。首先，為了滿足該檢測方法，該基因興奮劑候選蛋白必須存在翻譯后修飾的過程，且能夠在血液中被檢測到[9]。它并不適用于那些以內源形式在同一組織中表達的蛋白質，比如胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，機械生長因子(Mechano Growth Factor，MGF)等，也不適用于不發(fā)生翻譯后修飾或只發(fā)生少量翻譯后修飾的蛋白[19]。

3.2 檢測外源導入基因序列

天然的基因組DNA(genomic DNA，gDNA)含有外顯子和內含子，經(jīng)過RNA剪接后，外顯子區(qū)域的序列被保留下來并被表達為蛋白質。而出于基因載體系統(tǒng)的安全性考慮以及載體容量的限制，外源導入的轉基因(transgenic DNA，tDNA)往往只含有外顯子，而沒有內含子區(qū)域。因此，檢測到不含內含子序列的基因即可作為外源基因或使用基因興奮劑的證據(jù)[6]。研究人員據(jù)此設計了一系列與外顯子-外顯子連接處特異性結合的DNA引物，利用PCR技術對外源tDNA進行檢測[9]。其原理如圖2所示[22]，當tDNA序列存在時，由于其不含內含子序列，這些與外顯子連接處結合的DNA引物便能同外源導入基因序列結合，從而發(fā)生特異性擴增，而gDNA由于存在內含子的阻隔無法與DNA引物結合，也就無法進行擴增。

圖2 利用PCR檢測轉基因DNA方法原理[22]Fig.2 Principle of transgenic DNA detection by PCR[22]

圖3 人類VEGF-A基因組結構和轉基因巢式引物策略[26]Fig.3 The genomic structure of human VEGF-A and transgene nested priming strategy.[26]

Beiter等[22]利用該原理發(fā)展了一套單拷貝引物內部跨內含子PCR(single-copy primer-internal intron-spanning PCR，spiPCR)系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了基因組DNA背景下EPO tDNA和VEGF tDNA的單拷貝檢測。Ni等[23]和Baoutina等[24 - 25]采用定量PCR(quantitative PCR，qPCR)的方法對血清中EPO tDNA進行檢測。Ni和Guiner等[23]發(fā)現(xiàn)對非人類靈長類動物肌肉注射質粒載體或rAAV載體后，能在血液中檢測到較高濃度的tDNA，且rAAV基因組能在白細胞中長期存在(維持57周)。另外，Beiter等[26]和Moser等[27]又在檢測體系中引入巢式PCR(nested PCR)的方法，其原理如圖3所示[26]。巢式PCR使用兩對DNA引物進行兩次PCR擴增，第二對引物結合在第一次PCR產(chǎn)物內部，減少了錯誤片段擴增的幾率，因此相比于常規(guī)PCR，巢式PCR特異性更高，靈敏度也更高，適用于基因興奮劑的長期檢測[9]。Beiter等[26]利用巢式PCR在基因組DNA背景下實現(xiàn)了對VEGF、IGF-1、EPO、FST(follistatin，卵泡抑素)及GH-1外源cDNA兩個拷貝數(shù)的檢測，并在小鼠模型中證實了該方法的可行性。Neuberger等[28]則建立了檢測EPO轉基因的定量巢式PCR方法，在肌肉注射基因載體8至14周的獼猴白細胞中檢測到了病毒載體的存在。除此之外，Moser等[29]還引入數(shù)字液滴PCR(digital droplet PCR，ddPCR)的方法對小鼠全血樣品中IGF-1 cDNA進行檢測。

除PCR技術以外，Salamin等[30]還提出可以利用環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)對基因興奮劑進行檢測。然而，這些基于外源導入基因含有外顯子-外顯子連接序列的檢測方法也是相對容易躲避的。隨著基因治療技術的發(fā)展，加上這一檢測原理逐漸被人所知，對外源導入基因序列進行稍許改動，或者引入同義突變位點，或者在外顯子之間插入內含子等方法均有可能被發(fā)展出來，造成假陰性結果[31]，從而躲避基于這種原理的檢測。

近些年來，二代測序(Next-Generation Sequencing，NGS)技術得到了廣泛的應用，并為全基因組測序提供了快速可行的方法。NGS技術可以有效地應用于監(jiān)測轉基因生物(Genetically Modified Organisms)[32]，且從原理上可以檢測到所有種類的基因興奮劑。因此，NGS看上去是一種非常有前景的基因興奮劑檢測方法。然而有一些因素限制了NGS技術的適用性。根據(jù)動物與人類的生物體內分布研究表明，血清中轉基因分子的可檢測性只能維持幾天或幾周，而在血細胞中轉基因可檢測性則可以持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年[26,33 - 34]。而由于全血樣品中高水平gDNA背景的存在，所需的測序覆蓋度不適用于NGS，因此還需要進行靶向測序或者在測序之前進行PCR預擴增，增加了檢測成本與檢測所需時間[9]。de Boer等[31]采用了靶向二代測序的方法對潛在的基因興奮劑EPO、IGF1、IGF2、GH1及GH2等cDNA進行檢測，成功檢測到了上述cDNA所有的外顯子-外顯子連接區(qū)域序列，以及相關的啟動子序列和質粒序列。

3.3 檢測基因載體

通過檢測基因載體本身來鑒定是否使用了基因興奮劑從理論上講不失為一種可行的方案，但這種方法實施起來相當困難。首先，對于病毒載體來說，被試者很可能通過其它途徑受到病毒感染，比如腺病毒有多種在人群中流行的血清型，而不同病毒載體在體液中持續(xù)時間也不盡相同。而對于質粒載體而言，因為質粒DNA在血漿中半衰期極短，極大地限制了在循環(huán)系統(tǒng)中檢測質粒載體的機會。在小鼠靜脈注射質粒載體30 min后，血漿中檢測到的質粒DNA僅占輸入質粒DNA的0.3%至13%[19]。上述問題都使得通過檢測基因載體來監(jiān)測基因興奮劑的方法存在較大的局限性。

3.4 間接檢測方法

除了上文提到的直接檢測法以外，還發(fā)展了一些間接檢測基因興奮劑的方法[3,6]。通過評估宿主對病毒載體、引入的DNA序列或者表達出的轉基因蛋白本身的免疫反應，可以輔助判斷是否使用了基因興奮劑[3]，但這些免疫反應也有可能是宿主受到其它途徑的病毒感染導致，由此從血液中檢測到的抗體就有可能造成假陽性的結果[6,9]。另外，通過長期監(jiān)測運動員的表達圖譜、蛋白質圖譜或代謝圖譜也有助于得到有關基因表達發(fā)生變化的相關信息，然而這一方案則需要建立龐大的相關信息數(shù)據(jù)庫，同時也存在著假陽性的可能[9]。

綜上所述，雖然目前已經(jīng)發(fā)展出了一系列基因興奮劑的檢測方法，但其中較有實用價值的方法只有檢測轉基因蛋白和轉基因序列兩種。其中，檢測轉基因蛋白的方法并不適用于所有基因興奮劑候選蛋白，而檢測轉基因序列的方法無法用于含有內含子序列的外源基因上。

4 染色體步移技術

如前文所述，目前發(fā)展出的基因興奮劑檢測技術，特別是針對外源基因序列的檢測方法，其原理主要通過PCR等擴增技術對已知的一些基因興奮劑候選基因進行定性或定量檢測，以判斷是否存在外源導入的基因。而與這些基因序列相鄰的側翼序列，可能是一些基因載體上的序列，也是經(jīng)過基因整合進入染色體上的序列都是未知的，且無法通過上述PCR等擴增技術獲取相關信息。而染色體步移技術(Genome Walking，GW)便是通過已知序列的基因片段來獲取該片段側翼未知序列信息的方法[35]。根據(jù)不同原理，染色體步移技術主要可分為反向PCR(inverse PCR，I-PCR)、連接介導PCR(ligation-mediated PCR)及隨機引物PCR(randomly primed PCR)等不同種類[36]。

圖4 反向PCR原理[37]Fig.4 The principle of inverse PCR[37]

4.1 反向PCR

1988年，Triglia等[37]以及Ochman等[38]首次提出反向PCR的概念，并用該方法對已知DNA區(qū)域兩側的未知序列進行擴增，其原理如圖4所示[37]。在進行反向PCR時，首先選擇在已知序列區(qū)域沒有酶切位點的限制性內切酶，嘗試水解在其兩側的未知序列區(qū)域內可能存在的酶切位點，產(chǎn)生粘性末端。之后在DNA連接酶的作用下，將序列兩邊酶切后產(chǎn)生的末端相互連接形成環(huán)狀DNA。最后再根據(jù)已知序列設計的反向PCR引物進行擴增，通過測序即可得到已知序列上下游側翼未知區(qū)域的序列信息[37 - 38]。不過，由于側翼區(qū)域序列未知，經(jīng)過限制性內切酶水解后得到的DNA片段長度難以把握，因此需要多次設計實驗才能獲得目標基因的全長信息。另外，由于環(huán)化過程也較難控制，非常容易得到由不同酶切片段形成的線性連接產(chǎn)物，造成非特異性擴增。

Tsaftaris等[39]在反向PCR的基礎上進一步引入滾環(huán)擴增(Rolling Circle Amplification，RCA)的思路。經(jīng)過T4連接酶連接形成的環(huán)狀雙鏈DNA作為模板，在Phi29 DNA聚合酶的作用下發(fā)生滾環(huán)擴增，然后再以滾環(huán)擴增產(chǎn)物作為模板通過反向PCR對未知區(qū)域序列進行擴增及測序，對藏紅花(Crocus Sativus)的啟動子區(qū)域序列進行了鑒定[39]。Thorsen等[40]利用該方法對白血病患者骨髓DNA樣品進行檢測，鑒定出了TAF15-ZNF384及BCR-ABL1兩種融合基因，顯示了該方法在檢測染色體斷裂點和由新的染色體易位引起的融合基因上的適用性。

4.2 連接介導PCR

1989年，Mueller等[41]和Pfeifer等[42]提出了連接介導PCR的方法。連接介導PCR是指在限制性內切酶對目標DNA酶切后，在酶切產(chǎn)物末端連接已知序列的接頭。然后根據(jù)兩端接頭序列設計引物進行PCR，最終獲得目標DNA序列。不過，可以預見，連接介導PCR在研究復雜樣品時會產(chǎn)生大量非特異性擴增產(chǎn)物[35]。為了解決這一問題，研究人員開對連接介導PCR進行了多種不同的改進。Rosenthal等[43]和Lagerstrom等[44]開發(fā)了捕獲PCR(capture PCR)的方法。通過連有生物素標記的引物首先進行單向PCR，然后利用鏈霉親和素包被的磁珠富集帶有生物素的PCR產(chǎn)物單鏈，最后通過無標記的接頭引物進行第二次PCR得到目標片段序列。由于該方法利用了生物素標記的特異性引物，因此極大提高了連接介導PCR的特異性。與此同時該方法操作則更加繁瑣，成本也相應提高[43]。此外，步降PCR(step down PCR)[45]，T-linker特異性PCR(T-linker-specific ligation PCR)[46]等方法也被相繼開發(fā)出來用于獲取未知基因序列。

4.3 隨機引物PCR

與上述兩種方法不同，隨機引物PCR無需復雜繁瑣的限制性內切酶酶切、連接等操作步驟，而是通過設計隨機引物與特異性引物組合的方式對未知序列基因進行擴增，主要有單邊PCR(one-sided PCR)及熱不對稱交錯PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR)等[47]。不過，隨機引物PCR雖然不需要進行酶切、連接等操作，卻要求更加復雜的引物設計以及操作繁瑣的PCR步驟。另外，由于該方法存在隨機引物的非特異性結合作用，在進行PCR擴增時會逐步積累大量的非特異性產(chǎn)物。

5 總結與展望

基因治療技術的發(fā)展也帶來了基因興奮劑的濫用問題，而在限制基因興奮劑的使用上，建立基因興奮劑的檢測方法則顯得至關重要。在目前提出的一系列基因興奮劑檢測策略中，檢測外源基因表達蛋白的策略能夠檢測EPO基因興奮劑，但并不適用于所有基因興奮劑的候選基因蛋白。而檢測外源基因序列的策略能夠檢測無內含子的外源導入基因，并且已發(fā)展出多種檢測模式，包括實時定量PCR[23 - 25]、巢式PCR[26 - 28]、數(shù)字液滴PCR[29]、環(huán)介導等溫擴增[30]及二代測序[32]等，實現(xiàn)了對生物體內外源導入基因的長期檢測。不過，通過引入同義突變位點或在外顯子間插入內含子等方法對基因興奮劑進行改動即可逃避該類方法的檢測，限制了這一檢測策略的使用。另外，檢測基因載體或免疫反應等策略容易受到自然病毒的干擾，從而導致假陽性結果。

綜上所述，雖然目前已經(jīng)發(fā)展出了一些基因興奮劑的檢測方法，但只有少數(shù)檢測策略具有較高的實用性，同時也存在一定的局限性。因此，還需要繼續(xù)開發(fā)新的更簡便、高效的檢測方法，為杜絕基因興奮劑的濫用提供強有力的監(jiān)控手段。