劉 丹， 畢德瀧， 陳 鑫， 王立鳳

(牡丹江師范學(xué)院， 黑龍江 牡丹江 157012)

狗棗獼猴桃﹝Actinidiakolomikta(Maxim. et Rupr.) Maxim.﹞，別名深山木天蓼、狗棗子，獼猴桃屬大型落葉藤本植物，分布于我國(guó)黑龍江、吉林、遼寧、四川、云南等地，俄羅斯遠(yuǎn)東、朝鮮半島及日本也有分布，其果實(shí)柔軟多汁、酸甜可口、維生素C含量較高，是一種保健型水果，其葉片隨季節(jié)會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，成綠、白、粉、淺紅和紫紅的斑狀彩葉。狗棗獼猴桃是最為耐寒的獼猴桃品種之一，是良好的抗寒育種資源[1-3]。熱激蛋白(heat shock protein，HSP)是真核生物中普遍存在的一類蛋白，在絕大多數(shù)植物中起著關(guān)鍵作用。根據(jù)其分子量大小可以分為5個(gè)家族，HSP100、HSP90、HSP70、HSP60及小分子，小分子HSP普遍約20 kDa，故統(tǒng)稱為HSP20[4]。在逆境環(huán)境中，HSP能夠?yàn)榉€(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)、輔助蛋白的運(yùn)輸和折疊、維持細(xì)胞機(jī)能用以提高植物體對(duì)脅迫的適應(yīng)性[5]。PRIETO-DAPENA P[6]等研究發(fā)現(xiàn)，HSP超表達(dá)能夠增強(qiáng)向日葵種子的活性，并能延長(zhǎng)種子活性。辣椒中的HSP20可以減輕高溫對(duì)細(xì)胞造成的損害[7]。另外，HSP上調(diào)表達(dá)可以提高番茄在低溫環(huán)境中的防御機(jī)制[8]。HSP對(duì)鹽堿、重金屬、氧化脅迫、生長(zhǎng)發(fā)育均具有重要作用[9-10]。因此，以狗棗獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考，篩選到AkHSP20的cDNA序列，利用生物信息學(xué)方法對(duì)其理化性質(zhì)、疏水性/親水性、蛋白結(jié)構(gòu)功能域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)及同源性等方面進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，以期為狗棗獼猴桃AkHSP20功能研究提供參考。

1數(shù)據(jù)來(lái)源與方法

1.1材料來(lái)源

狗棗獼猴桃AkHSP20的cDNA序列從林木育種實(shí)驗(yàn)室獲得；中華獼猴桃變種(Actinidiachinensisvar.chinensis，PSS17576.1)、茸毛煙草(Nicotianatomentosiformis，XP_009609365.1)、歐洲橄欖(Oleaeuropaeavar.sylvestris，XP_022851870.1)、茶樹(Camelliasinensis，XP_028099037.1)、葡萄(Vitisvinifera，XP_002280731.1)、棗(Ziziphusjujuba，XP_015884425.1)、阿拉比卡豆(Coffeaarabica，XP_027084273.1)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii，XP_012443093.1)、蓖麻(Ricinuscommunis，XP_002516108.1)、長(zhǎng)蒴黃麻(Corchorusolitorius，OMO86512.1)、克萊門柚(Citrusclementina，XP_006453035.1)、萵苣(Lactucasativa，XP_023735799.1)、榴蓮(Duriozibethinus，XP_022750059.1)、豇豆(Vignaunguiculata，XP_027939165.1)、非洲相思子(Abrusprecatorius，XP_027356922.1)等植物氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。

1.2方法

狗棗獼猴桃AkHSP20的理化性質(zhì)用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行分析；親水/疏水性用(https://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行預(yù)測(cè)；跨膜結(jié)構(gòu)采用SignalP-4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)進(jìn)行預(yù)測(cè)；保守結(jié)構(gòu)域用NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)進(jìn)行在線分析；NetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetOGlyc/)對(duì)O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用SOPMA及 PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用在線 SWISS-MODEL(http://swissmodel.Expasy.org/)軟件分析三級(jí)結(jié)構(gòu)。從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得15條不同植物的HSP氨基酸序列信息，Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析親緣性。

2結(jié)果與分析

2.1AkHSP20的理化性質(zhì)

經(jīng)對(duì)狗棗獼猴桃AkHSP20氨基酸序列進(jìn)行分析表明，AkHSP20基因編碼區(qū)(CDS)共編碼194個(gè)氨基酸，分子量2 1575.40 D，理論等電點(diǎn)為5.44，分子式為C936H1517N271O299S7，總原子數(shù)3 030，不穩(wěn)定指數(shù)(instability index, Ⅱ)為45.37，根據(jù)其不穩(wěn)定指數(shù)可判定該AkHSP20蛋白為非穩(wěn)定性蛋白。另外，AkHSP20親水性(GRAVY)的平均水平為-0.683，進(jìn)一步說(shuō)明其為非穩(wěn)定性蛋白。該蛋白中含量最多的為谷氨酸，占11.3%，其次為甘氨酸和纈氨酸，各占8.8%，含量最少的為組氨酸，為1.0%(圖1)。根據(jù)親水/疏水性ProtScale分析預(yù)測(cè)得出(圖2)，該基因蛋白最大值為1.911，最小值為-3.989，氨基酸的負(fù)值多且分值大。因此，該蛋白為親水蛋白。

2.2AkHSP20的信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)

該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示D值為0.114(<0.5)，不存在信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)(圖3)。

注(Note): Ala，丙氨酸；Arg，精氨酸；Asn，天冬酰胺；Asp，天冬氨酸；Cys，半胱氨酸；Gln，谷氨酰胺；Glu，谷氨酸；Gly，甘氨酸；His，組氨酸；Ile，異亮氨酸；Leu，亮氨酸；Lys，賴氨酸；Met，蛋氨酸；Phe，苯丙氨酸；Pro，脯氨酸；Ser，絲氨酸；Thr，蘇氨酸；Trp，色氨酸；Tyr，酪氨酸；Val，纈氨酸；Pyl，吡咯賴氨酸；Sec，硒半胱氨酸。

圖1狗棗獼猴桃AkHSP20基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸

Fig.1 Amino acid compositions of protein encoded by theAkHSP20 gene

圖2AkHSP20蛋白的親水/疏水性

Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of AkHSP20

注：C 值，原始剪切位點(diǎn)的分值；S 值，信號(hào)肽的分值；Y 值，綜合剪切位點(diǎn)的分值。

Note: C, the value of the original shear site; S, the value of signal peptide; Y, the value of the integrated shear site.

圖3AkHSP20蛋白的信號(hào)肽

Fig.3 Signal peptide of AkHSP20

2.3AkHSP20的結(jié)構(gòu)域

經(jīng)比對(duì)后對(duì)AkHSP20保守序列及蛋白家族進(jìn)行預(yù)測(cè)，AkHSP20是HSP20基因家族的成員( ID 10157978 )，第52～142氨基酸的序列區(qū)域?yàn)镠SP20的保守結(jié)構(gòu)域(圖4)。

圖4AkHSP20的蛋白保守序列

2.4AkHSP20的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)

采用SOPMA對(duì)AkHSP20的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)(圖5)，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中形成螺旋(Helix)的可能為37.63%，形成延伸鏈(Strand)可能為21.65%，6.70%可能形成轉(zhuǎn)角(Turn)，34.02%為無(wú)規(guī)卷曲(Random coil)，無(wú)特殊結(jié)構(gòu)。AkHSP20蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖6)為，該結(jié)構(gòu)主要構(gòu)件為無(wú)規(guī)卷曲及螺旋，在第52～142個(gè)氨基酸中存在HSP20的保守結(jié)構(gòu)。

圖5AkHSP20的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5AkHSP20蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn)

經(jīng)過(guò)NetOGlyc方法預(yù)測(cè)得到AkHSP20含有6個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別在第36、155、162、170、179、189氨基酸。采用PredictProtein分析(表1)，AkHSP20含有2個(gè)酪蛋白磷酸激酶II磷酸化位點(diǎn)(Casein kinase II phosphorylation site)、4個(gè)十四烷?；稽c(diǎn)(N-myristoylation site)、1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(Tyrosine kinase phosphorylation site)、1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(Protein kinase C phosphorylation site)。

圖6AkHSP20蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

表1AkHSP20蛋白的修飾位點(diǎn)

2.6氨基酸序列的同源性

經(jīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得15條不同植物的HSP20氨基酸序列信息與AkHSP20氨基酸序列進(jìn)行同源性分析表明， AkHSP20與中華獼猴桃原變種親緣相近，而其他植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖7)。

注(Note)：中華獼猴桃變種(Actinidiachinensisvar.chinensis)、茸毛煙草(Nicotianatomentosiformis)、歐洲橄欖(Oleaeuropaeavar.sylvestris)、茶樹(Camelliasinensis)、葡萄(Vitisvinifera)、棗(Ziziphusjujuba)、阿拉比卡豆(Coffeaarabica)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)、蓖麻(Ricinuscommunis)、長(zhǎng)蒴黃麻(Corchorusolitorius)、克萊門柚(Citrusclementina)、萵苣(Lactucasativa)、榴蓮(Duriozibethinus)、豇豆(Vignaunguiculata)、 非洲相思子(Abrusprecatorius)。

圖7HSP的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.7 HSP system phylogenetic tree

3結(jié)論與討論

HSP在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫等生理生化過(guò)程中起著直接或間接的關(guān)鍵作用。目前，大豆、辣椒、向日葵、茶樹、番茄中的HSP基因已經(jīng)被克隆，并在植物的抗逆中發(fā)揮重要作用。通過(guò)狗棗獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選狗棗獼猴桃AkHSP20基因cDNA序列信息，利用在線分析方法對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示：AkHSP20基因共編碼194個(gè)氨基酸，cDNA上第151～732個(gè)堿基區(qū)域?yàn)榫幋a區(qū)(CDS)，蛋白中含量富含谷氨酸，屬于親水非穩(wěn)定的蛋白，不存在信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)，保守結(jié)構(gòu)為HSP20(ID 10157978)家族的一員，主要構(gòu)件為無(wú)規(guī)卷曲及螺旋，蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)較多。從植物親緣關(guān)系進(jìn)化樹上分析，AkHSP20與中華獼猴桃原變種親緣相近，而與其他植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該研究為進(jìn)一步挖掘AkHSP20基因的功能奠定了基礎(chǔ)。