劉詩詩

(廣西壯族自治區(qū)桂林茶葉科學(xué)研究所， 廣西 桂林 541001)

植物內(nèi)生真菌(endophyte)是指生活史的部分或全部階段生活于健康植物各個(gè)組織和器官內(nèi)部的真菌[1]。植物內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與其宿主植物相同或相似的生理活性成分以及特殊活性物質(zhì)，這些真菌對(duì)宿主植物幾乎無害，與植物形成相互依存的共生關(guān)系或不太密切的共生關(guān)系[2]。近年來，一些具有特異功能的內(nèi)生菌不斷從植物中被分離出來，如高原等[3]從蒲公英中分離出內(nèi)生真菌中菌株 PGY5對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制效果，其最小抑菌濃度值約為0.16 mg/mL，最小殺菌濃度值約為0.31 mg/mL，且對(duì)其他植物病原菌如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等也具有較明顯的抑菌作用；施蕊等[4]從滇重樓中分離出98株內(nèi)生真菌，其中部分內(nèi)生真菌對(duì)供試植物土傳病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌等有一定的抑制作用，平均抑制率達(dá)82%以上，PPC-78對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用較為明顯，兩菌對(duì)峙試驗(yàn)時(shí)，抑制率高達(dá)100.00%，其發(fā)酵液的抑制作用也達(dá)83.11%。

中國是茶葉生產(chǎn)和貿(mào)易的發(fā)源地，茶葉一直是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。國內(nèi)對(duì)茶葉進(jìn)行的研究主要集中在茶葉品質(zhì)、栽培、組培、病蟲害防治等[5]方面，近幾年來，因?yàn)檗r(nóng)藥殘留新標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施，對(duì)茶樹病蟲害的防治提出了新要求，越來越多的學(xué)者對(duì)防治茶樹病蟲害的同時(shí)又能提高茶葉品質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)研究。目前已有研究表明，茶樹各個(gè)組織內(nèi)存在著獨(dú)特的內(nèi)生微生物菌群[6]，從這些內(nèi)生菌群中已成功分離出能抑制茶病原菌的菌株，如胡淑霞[7]從茶樹中分離出的芽孢桿菌對(duì)茶赤葉斑病、茶白星病及茶煤病有一定的抑制作用，其抑制率分別為74.87%、65.69%、55.67%；蔡麗等[8]從茶樹中分離出的26株內(nèi)生菌中，部分內(nèi)生菌對(duì)枯草芽孢菌、金黃色葡萄球菌、梨腐爛病菌等有較強(qiáng)的抑制作用；姜微等[9]從油茶健康葉片中分離1株解淀粉芽孢桿菌J-3-1，該菌株對(duì)茶根腐病菌、葉枯病菌、炭疽病菌及軟腐病菌均有拮抗活性，其抑菌圈半徑分別為12.5 mm、16.8 mm、13.5 mm、13.4 mm。因此，筆者等從茶樹不同組織器官中分離、純化內(nèi)生真菌，并對(duì)其進(jìn)行初步的抑菌活性試驗(yàn)及其發(fā)酵液抑菌活性研究、鑒定，以期為應(yīng)用茶樹內(nèi)生真菌資源防治病害奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試植物茶樹品種為桂香18號(hào)，茶樹根、莖、葉由廣西桂林茶葉研究所提供。

1.1.2供試病原菌病原菌分別為火龍果黑斑病菌〔Bipolariscactivora(Petrak)Alcorn〕、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp)、芒果蒂腐菌(BotryodiplodiatheobromaePat.)、小麥赤霉病菌(FusaHumgraminearumSehw)、蘋果輪紋病菌(Botrysphuaeriaberengerianaf.sp.piricola)、番茄早疫病菌(Altemariasolani)和芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioiles)，均由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3培養(yǎng)基

1) PDA培養(yǎng)基。去皮的200 g馬鈴薯切小塊，加水煮沸直到土豆完全熟透，然后用4層紗布過濾后加入20 g葡萄糖、18 g瓊脂，再定容至1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。分裝時(shí)100 mL培養(yǎng)基中加入100 μL抗生素，即抗生素的添加比例為1%。

2) 孟加拉紅培養(yǎng)基。31.6 g孟加拉紅，28 g瓊脂，加水煮沸至完全溶解，再定容至1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。分裝時(shí)加入1%的抗生素。

1.1.4試驗(yàn)儀器電子天平(CAV213C，奧豪斯儀器(上海)有限公司)、超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司)、數(shù)顯多孔恒溫水浴(BA-8，常州國華電器有限公司)、生化培養(yǎng)箱(SPX-280，寧波江南儀器廠)、微波爐(WD900G，佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司)、雙人超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、凝膠電泳擴(kuò)增儀(DYY-6B，北京六一儀器廠)、微生物搖床培養(yǎng)箱(ZHWY2102C，廣東康恒儀器有限公司)、高壓蒸汽滅菌鍋(LD2X-30KA，上海申安醫(yī)療機(jī)械廠)。

1.2茶樹內(nèi)生真菌的分離及純化

取茶樹的根、莖、葉，用水沖洗干凈去泥土，晾干。參照施蕊等[4]的方法進(jìn)行表面滅菌，即用0.1%的升汞浸泡根8 min、莖5 min、葉3 min，無菌水反復(fù)沖洗；75%乙醇浸泡30 s，無菌水反復(fù)沖洗；處理完畢后在無菌條件下將根、莖、葉切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，分別放入PDA培養(yǎng)基中，做好標(biāo)記，待培養(yǎng)基中有菌絲長出時(shí)，挑取前端菌絲接于另一新配置的PDA培養(yǎng)基中央，反復(fù)進(jìn)行該步驟以實(shí)現(xiàn)純化，最后將純化菌株接種到試管斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3活化病原菌

在無菌條件下，用已滅菌的接種環(huán)挑取保藏在試管中的病原菌尖端菌絲接于PDA培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用。

1.4茶樹內(nèi)生真菌的抑菌活性測(cè)定

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[10]，在無菌條件下，用打孔器(直徑0.5 cm)沿著菌落邊緣打取菌餅，將植物內(nèi)生真菌與植物病原菌菌餅接于PDA平板上，直線上的兩菌餅相距2.5 cm，同時(shí)以只接有內(nèi)生真菌或病原菌的平板為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔24 h觀察1次菌落的生長情況，直到對(duì)照病原菌菌落長至平板的2/3時(shí)拍照并記錄生長情況，計(jì)算抑菌效果。根據(jù)內(nèi)生菌株的抑菌率，選擇抑菌效果較好且廣譜性較強(qiáng)的菌株制備發(fā)酵液，并進(jìn)行發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定。

式中，DCK為對(duì)照組菌落半徑，D為處理組菌落半徑，0.25為初始菌餅半徑。

1.5優(yōu)選內(nèi)生真菌的生長速率測(cè)定

沿著菌落邊緣打菌餅，以菌絲朝下接入培養(yǎng)基上，置于28℃的恒溫培箱中培養(yǎng)，每隔24 h測(cè)量菌落半徑，記錄試驗(yàn)結(jié)果，分析內(nèi)生真菌生長規(guī)律。

1.6優(yōu)選內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定

1.6.1形態(tài)學(xué)鑒定 在無菌條件下，將篩選出的菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，用鑷子將已滅菌的蓋玻片斜插入培養(yǎng)基中，在光學(xué)顯微鏡下觀察該菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、菌絲、孢子等形態(tài)特征，并拍照記錄。篩選菌株接種于PDA平板中，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)數(shù)天，觀察菌落大小、顏色、形態(tài)、邊緣等特征，依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)該菌株進(jìn)行初步的鑒定[11]。

1.6.2分子生物學(xué)鑒定 從已培養(yǎng)好的篩選菌株平板中刮取內(nèi)生真菌菌絲，按照CTAB法[12]提取內(nèi)生真菌DNA，使用ITS1和ITS4通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照表1所示反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件：94℃變性5 min、58℃復(fù)性1 min、72℃延伸1 min、30個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物在瓊脂糖(濃度為1 %)凝膠電泳，利用Goldview染色[13]對(duì)菌絲、孢子、分生孢子及孢子梗染色，經(jīng)紫外分析儀觀察拍照并保存，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)真菌基因組DNA提取試劑盒[14]純化后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

表1茶樹內(nèi)生真菌DNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

Table 1 PCR amplification reaction system of endophytic fungus DNA from tea trees

物質(zhì)名稱Material加入量/LAdding amountTemplate5Forward Primer1Reverse Primer110× Buffer52.5Mm dNTPs4DNA Polymerase1ddH2O33Total volume50

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

從茶樹中分離出內(nèi)生真菌24株，從根中分離出7株，從莖中分離出8株，從葉中分離出9株，分別命名為G-1～G-7、J-1～J-8、Y-1～Y-9，分離的菌株生長情況及菌落特征見表2。

2.2內(nèi)生真菌的抑菌效果

從表3看出，24株內(nèi)生真菌中，J-7對(duì)芒果蒂腐病、香蕉枯萎病、芒果炭疽病、蘋果輪紋病、火龍果黑斑病及番茄早疫病的抑制抑菌效果較好且廣譜性較強(qiáng)，抑制率分別為70.14%、75.76%、75.86%、80.16%、85.59%和93.18%。

表2 茶樹內(nèi)生真菌的生長情況及菌落形態(tài)

注：“+”表示生長情況較弱，“++”表示生長情況好，“+++”表生長情況較好。

Note: "+" indicates weak growth, “++” indicates good growth, and “+++” indicates perfect growth.

表3茶樹內(nèi)生菌對(duì)各病菌的抑制率

注： G-1～G-7為茶樹根部內(nèi)生真菌，J-1～J-8茶樹莖內(nèi)生真菌，Y-1～Y-9茶葉內(nèi)生真菌。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異達(dá)0.05的顯著水平。

Note:G-1～G-7 is an endophytic fungus at the root of tea tree, J-1～J-8 is an endophytic fungus at the stem of tea tree, and Y-1～Y-9 is an endophytic fungus in tea leaf. Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

2.3內(nèi)生真菌J-7對(duì)植物病原菌的抑菌效果

從圖1看出，J-7對(duì)供試病原菌有明顯抑制作用，對(duì)番茄早疫病菌、火龍果黑斑病及蘋果輪紋病的抑制作用較為明顯。

2.4內(nèi)生真菌J-7生長速率和形態(tài)學(xué)特征

茶樹內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基上前5 d生長較快，6～9 d生長逐漸緩慢，10 d以后幾乎停止生長。

從圖2看出，J-7菌落近圓形，前期菌絲毛絨狀，白色，較致密，后期菌落底部中間呈褐色，凹凸不平，由內(nèi)至外顏色逐漸變淺，有色素?cái)U(kuò)散圈。菌絲有明顯的隔膜，多分枝，孢子梗呈梢子狀，孢子呈鐮刀狀(圖3)。

圖1內(nèi)生真菌J-7對(duì)各植物病原菌的抑菌效果

圖2J-7的菌落形態(tài)

圖3J-7的孢子梗(A)及菌絲(B)、孢子(C)形態(tài)

2.5內(nèi)生真菌J-7分子生物學(xué)鑒定

從圖4看出，J-7基因組DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增后在750 bp左右得到清晰的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶。在GeneBank基因庫中進(jìn)行其同源性搜索，發(fā)現(xiàn)J-7菌株與鐮刀菌屬ITS序列相似性接近于90%。綜合同源性比對(duì)結(jié)果和該鐮刀菌在真菌發(fā)育系統(tǒng)中的位置，從Genebank中選出7個(gè)菌株的ITS基因序列，應(yīng)用軟件進(jìn)行多重比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。從圖中看出，該菌株與鐮刀菌(Fusarium.sp)在一個(gè)分支中，與該菌株的進(jìn)化距離最接近，初步將菌株J-7鑒定為鐮刀菌屬(Fusarium.sp )。

注：1，2為菌株J-7的DNA，M為Marker

Note: 1, 2 are DNA of strain J-7, M is Marker.

圖4J-7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶

Fig.4 PCR products of J-7

圖5基于rDNA ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)采用普通的分離方法從茶樹的根、莖、葉不同組織中得到了24株內(nèi)生真菌，有7株來源于根、8株來源于莖、9株來源于葉，結(jié)果與游見明等[15]從茶樹中分離出的32株內(nèi)生真菌有一定差異，可能是研究材料的來源不同或筆者等的滅菌時(shí)間差異導(dǎo)致[16]。將24株內(nèi)生真菌分別與火龍果黑斑病、香蕉枯萎病、芒果蒂腐病、小麥赤霉病、蘋果輪紋病、番茄早疫病、芒果炭疽病、芒果炭疽病進(jìn)行拮抗活性測(cè)定，篩選出了1株來源于莖的內(nèi)生真菌J-7，該菌株對(duì)參試大部分病原菌有明顯抑制效果，為廣譜性內(nèi)生真菌，其對(duì)番茄早疫病的抑制效果較為明顯，對(duì)芒果蒂腐病、香蕉枯萎病、芒果炭疽病、蘋果輪紋病、火龍果黑斑病、番茄早疫病的抑制率分別為70.14%、75.76%、75.86%、80.16%、85.59%和93.18%。采用形態(tài)學(xué)鑒定方法和分子生物學(xué)鑒定方法對(duì)J-7菌株進(jìn)行初步的鑒定，該菌株屬鐮刀菌屬(Fusarium.sp)。