賈 元， 胡利娟， 馮 群， 田忠靜， 余 雨， 翁慶北， 朱 斌

(貴州師范大學 生命科學學院， 貴州 貴陽 550025)

石斛是蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)植物的統(tǒng)稱，其兼具藥用與觀賞價值。我國石斛有74種和2個變種，分布于秦嶺以南各省區(qū)，尤以云南為多[1]，絕大多數(shù)為野生狀態(tài)。石斛的藥用價值早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，其具有養(yǎng)陰生津、潤肺明目及滋陰清熱等功效[2]。石斛在自然條件下種子發(fā)芽率低，加上長期采挖和生態(tài)破壞，其野生資源環(huán)境受嚴重破壞而成為瀕危植物，導致市場上石斛類藥材植物緊缺。因此，金石斛屬(Flickingeriaalbopurpurea)等近緣屬植物常混作石斛類藥材使用[3]。

目前，鑒定物種親緣關系的方法有RAPD[4-5]、AFLP[6-7]、RFLP[8-9]、ISSR[10-11]及DNA條形碼[12-13]等，其中ISSR分子標記技術結(jié)合了RAPD和SSR分子標記的優(yōu)點，具有成本低、多態(tài)性高及快速準確等特點，已用于不同石斛的群居遺傳多樣性研究[14]，并取得良好效果。近年來，為保護石斛的野生資源及保障市場需求，對石斛進行相應的引種栽培及雜交選育使石斛屬植物種質(zhì)資源越來越復雜，對石斛資源親緣關系進行分析，將為石斛的起源、進化研究提供理論依據(jù)，也將為野生石斛資源的有效利用及保護提供理論支撐。鑒于此，結(jié)合前人的研究，采用ISSR標記技術(簡單重復序列間擴增)運用11條引物對采自西南地區(qū)的24份石斛植物材料進行遺傳多樣性及親緣關系分析，以期為更好地保護、開發(fā)和選育優(yōu)良石斛品種提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

石斛：24份石斛分別采自云南、貴州等地，依據(jù)《中國植物志》完成鑒定，所取材料栽培于貴州師范大學溫光培養(yǎng)室。試驗材料名稱及采集地點詳見表1。

儀器與試劑：ETC811 PCR儀，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；DYCP-31E型電泳槽，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)K8360，北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司；CTAB、Tris-base、EDTA、苯酚、氯仿、異戊醇、鹽酸、無水乙醇、無菌去離子水等，貴州凱信生物科技有限公司；2 × Taq MasterMix (Dye)，北京康為世紀生物科技有限公司；ISSR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1石斛材料名稱及采集地點

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取從實驗室栽培的石斛植株上摘取幼嫩葉片，參考CTAB法[15]加以改進提取植物基因組DNA。具體方法：剪取石斛幼嫩葉片0.1 g放在研缽中，加入750 μL 2% CTAB充分研磨，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，65℃水浴1 h(每隔20 min搖勻1次)；取出離心管冷卻到室溫在通風櫥里通風狀態(tài)下加入750 μL的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，上下顛倒混勻；12 000 r/min離心15 min，取上清液500 μL于新的離心管中，然后向上清中加入-20℃的無水乙醇1 mL沉淀DNA，-20℃存放20 min；8 000 r/min離心5 min去除上清液，沉淀用75%的乙醇清洗3次，第3次清洗時不必倒出，放置過夜，第2天離心倒掉上清液；室溫下晾干或通風櫥干燥后加入 200 μL無菌去離子水溶解后置-20℃保存；取2 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

1.2.2引物篩選ISSR引物的合成根據(jù)楊立昌等[15-17]公布的引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成，通過用合成的20條引物對8份石斛植物材料基因組DNA進行預試驗擴增，從中篩選出擴增產(chǎn)物條帶清晰、多態(tài)性較好的引物用于24份石斛種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。

1.2.3ISSR-PCR擴增參考ISSR反應體系[17-18]稍加改進：PCR反應體積20 μL，包含稀釋過的DNA模板2.0 μL，MIX 8.0 μL引物(10 μmol/L)1.0 μL，無菌去離子水9 μL。PCR擴增程序參考孔瓊等[17-18]并加以改進，具體：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，退火45 s(退火溫度由引物而定，具體見表2)72℃延伸2 min，共45個循環(huán)，72℃復性7 min，4℃保存PCR產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠在1×TAE緩沖液中電泳檢測。使用Super DNA marker 標定擴增片段長度，在90 V電壓下，電泳1.5 h后置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察、照相，檢測ISSR-PCR譜帶?？紤]條帶清晰度，因而采用17孔電泳槽梳子加大擴增產(chǎn)物劑量，因此下面擴增電泳圖譜僅部分呈現(xiàn)。

表2 不同ISSR引物序列及ISSR擴增情況

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)拍攝的照片，統(tǒng)計清晰、穩(wěn)定、可分辨的擴增條帶，有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，構(gòu)成0/1矩形圖，利用NTSYS 2.10 SHAN程序中的UPGMA(非加權(quán)平均距離法)對樣品進行聚類分析，構(gòu)建24份石斛植物的親緣關系樹狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1供試石斛的擴增情況

從石斛的擴增電泳圖譜(圖1)看出，11條引物對24份石斛材料的擴增長度在250～2 000 bp。從表2看出，共檢測出151個擴增位點，平均每條引物擴增位點為13.7個；其中多態(tài)性位點148個，多態(tài)性位點率為98.01%。24份石斛總擴增條帶1 084條，各石斛擴增條帶在36～53條，平均45.17條；其中多態(tài)性條帶有1 012條，占比為93.4%。說明，供試樣品具有較高的多態(tài)性。

2.2供試石斛的遺傳相似性及親緣關系

UPGMA法構(gòu)建供試材料的聚類結(jié)果(圖2)顯示，11條引物能將24份石斛分開，遺傳相似系數(shù)在0.63～0.78，表明供試樣品具有較近的親緣關系。在相似系數(shù)0.68處，可將24份石斛材料分為7個類群。

注：M為marker，1～15分別對應表1中編號為1～15的石斛材料。

Note: M is a marker, and 1-15 correspond toDendrobiummaterials numbered 1-15 in Table 1, respectively.

圖1引物UBC900和 CTC4Rcb對石斛的ISSR擴增圖譜

Fig.1 ISSR amplification of primers UBC900 and CTC4Rcb onDendrobium

圖224份石斛植物樣品的聚類分析

Ⅰ類包括鐵皮石斛、長蘇石斛和報春石斛。Ⅱ類分為A組和B組，A組包括小龜背石斛、澳洲石斛、血喉石斛、櫻石斛、黃喉石斛、具槽石斛、春石斛和獨角石斛，B組包括重唇石斛、鼓槌石斛、霍山石斛、天宮石斛、尖刀唇石斛和黑毛石斛，其中重唇石斛和鼓槌石斛是24份石斛材料中親緣關系最近的，遺傳系數(shù)超過了0.77。Ⅲ類由金石斛屬的金果石斛構(gòu)成，說明，金石斛屬與石斛屬存在一定差異。Ⅳ類包括美花石斛和短棒石斛。Ⅴ類包括疊鞘石斛和大苞鞘石斛。Ⅵ類僅有竹葉石斛，Ⅶ類僅有秋石斛，秋石斛與其他23份石斛材料的距離最遠，遺傳相似系數(shù)僅為0.63。

3結(jié)論與討論

在傳統(tǒng)分類中，吉占和[19]把我國石斛屬的74個種劃分為12個組，分別是禾葉組、頂葉組、石斛組、心葉組、瘦軸組、叉唇組、距囊組、黑毛組、草葉組、基腫組、劍葉組和圓柱葉組。研究結(jié)果顯示，Ⅰ類的鐵皮石斛、長蘇石斛和報春石斛，Ⅳ類的美花石斛和短棒石斛，Ⅴ類的疊鞘石斛和大苞鞘石斛均歸屬石斛組，其各自組為一類群，與傳統(tǒng)的分類一致；但Ⅱ類由2個組混合在一起聚為同一類，與傳統(tǒng)分類不一致。將Ⅳ類的美花石斛和短棒石斛與盧家仕等[16]對不同產(chǎn)地石斛屬種質(zhì)資源的ISSR遺傳多樣性分析聚為一類的研究結(jié)果一致，與武榮花[20]的把Ⅰ類的鐵皮石斛、長蘇石斛和報春石斛聚為同一類的研究結(jié)果一致，但與朱勝男等[21]的研究有部分不一致。

聚類分析結(jié)果與傳統(tǒng)的分類方法和前人對部分石斛聚類分析基本一致，但有少數(shù)存在一定的差異，可能與石斛長期人為或者自然的異花授粉和自然選擇及遺傳背景有關。某些種之間的形態(tài)特征相差甚遠，有些石斛種后代有可能形成多種的基因型，根據(jù)形態(tài)學和地理分布進行分類具有一定的局限性，外部的形態(tài)特征受隱性基因、環(huán)境各方面條件的影響，僅從形態(tài)學和地理分布不能科學判斷其親緣關系的遠近。石斛的親緣關系需要從形態(tài)學與分子相結(jié)合來研究，才能得出較為準確的結(jié)論。DNA分子標記不受環(huán)境影響，能直接反應基因組DNA間的差異性，能夠在分子水平上對植物進行準確分類和鑒別。但是石斛的遺傳背景較為復雜，單一的分子標記分析其遺傳多樣性不夠客觀，今后應結(jié)合多種標記技術和傳統(tǒng)形態(tài)學方法對石斛屬植物進行深入研究，對來自不同地方的品種及同名異種、同種異名的品種資源進行分析，對石斛進行準確分類和鑒別，進而為藥用及觀賞等石斛種質(zhì)資源的合理開發(fā)和利用提供更好的借鑒。