黃保宏， 沈守國, 楊婷婷

(1.安徽科技學院 農(nóng)學院，安徽 鳳陽 233100；2.霍山職業(yè)學校，安徽 霍山 237299)

煙草青枯病由青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一種危害重大、毀滅性強、分布極廣的土傳性細菌病害[1]，在浙江、福建、河南、遼寧等大部分煙草種植區(qū)均有發(fā)生，已對煙草生產(chǎn)造成嚴重威脅。煙草青枯病菌主要通過傷口侵染煙株，罹病煙株典型癥狀是發(fā)病部位一側(cè)葉片枯萎但仍是綠色，其莖部常見褪綠條斑，且發(fā)病根部一側(cè)根須變黑腐爛，另一側(cè)根須大部分正常[2]，故呈“青枯”狀；發(fā)病中后期葉片全部萎蔫黃化，根部完全變黑，用力擠壓發(fā)病株莖切口，會有黃白色菌膿出現(xiàn)，病株莖和葉脈導管變黑[3]。而且?guī)Ь寥篮吞镩g病殘體是煙草青枯病菌主要越冬場所[4]。因此，在煙苗栽種時應避免對煙株造成傷口，并及時處理田間土壤和病殘體，避免傳染病害。

利用拮抗菌防治病害已成為近年來研究的熱點[5]，其具有對人畜無副作用、環(huán)境兼容性好、材料來源廣泛等特點。國內(nèi)外學者對煙草青枯病防治提出了很多有效的防治措施，生物防治成為煙草綠色防控流行趨勢之一。其中，利用拮抗菌防治青枯病越來越受到重視。

目前，有關(guān)運用農(nóng)用抗生素與拮抗菌聯(lián)合防治研究較為少見，本試驗中將農(nóng)用硫酸鏈霉素與青枯病拮抗菌發(fā)酵液等兩種抗生素按不同體積比例混合，以探究農(nóng)用抗生素對煙草青枯病拮抗菌發(fā)酵液聯(lián)合抑菌作用，篩選適合安徽省優(yōu)質(zhì)煙區(qū)的抗生素資源，為煙草青枯病的生物防控提供依據(jù)，開發(fā)出防治煙草青枯病的新思路。

1 材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：牛肉粉3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，pH值7.3，H2O 1 000 mL，121 ℃滅菌。

1.2 試驗器材

YKZ智能人工氣候箱(浙江托普儀器有限公司)；XQY-LS-60-SII立式蒸汽滅菌箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；101A-3d潔凈工作臺(上海比郎儀器有限公司)；SW-OJ-2F旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(寧波江南儀器廠制造)；JC5012臺式恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海市安亭電子儀器廠)；SW-QJ-2F分析天平(寧波江南儀器廠制造)。

1.3 供試菌株與農(nóng)用抗生素

供試煙草青枯病菌、拮抗菌AKJK-2013-02均由安徽科技學院植物保護學實驗室提供；72%農(nóng)用硫酸鏈霉素(成都惠普生物工程有限公司)。

1.4 煙草青枯病拮抗菌拮抗物質(zhì)粗提液的制備

在28 ℃條件下，將5 mL拮抗菌AKJK-2013-02接種到裝有NA液體培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)3 d，常溫下以8 500 r/min離心0.5 h培養(yǎng)，提取其上清液，再用孔徑5 μm微孔濾膜過濾后放在500 mL的棕色廣口瓶中置于冰箱，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 農(nóng)用硫酸鏈霉素對煙草青枯病拮抗菌發(fā)酵液抑菌活性的測定

采用平板對峙法[5]測定，于2017年5月3日設(shè)置6個處理(V農(nóng)用硫酸鏈霉素︰V拮抗菌發(fā)酵液=5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4、0∶5)，將這6個處理分別混合搖勻后，倒入融化的5 mL NA培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)基凝固后進行平板拮抗試驗，以不加農(nóng)用硫酸鏈霉素和煙草青枯病拮抗菌發(fā)酵液為對照(CK)，3次重復/處理。用直徑5 mm打孔器將待測煙草青枯病菌菌落打成小圓餅，反放在直徑9 cm培養(yǎng)皿中央并倒置在28 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，于第3、5、7天分別觀察青枯病菌菌落的生長形態(tài)，并測量菌圈直徑，計算抑菌率。

1.6 盆栽試驗測定農(nóng)用硫酸鏈霉素與拮抗菌AKJK-2013-02混合液的抑菌活性

2017年5月17日，將按V農(nóng)用硫酸鏈霉素∶V拮抗菌發(fā)酵液= 5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4、0∶5等比例搖勻配制成混合液進行盆栽試驗, 以不加農(nóng)用硫酸鏈霉素和煙草青枯病拮抗菌發(fā)酵液的為對照(CK)。3次重復/處理，3株煙苗/重復，用無菌土培育煙苗直至3葉期進行花盆移栽[6]。移栽后采用灌根接種的方法，將上述6個處理的混合液灌入染病煙株根際，放置于溫室28～35 ℃條件下培養(yǎng)。觀察第10、15、20天煙株發(fā)病情況，計算發(fā)病率和病情指數(shù)，并計算相對防效[7]。

植物發(fā)病率=(染病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100%；

植物病情指數(shù)=[∑(各級病株數(shù)×相應級數(shù))/調(diào)查總株數(shù)×最高級別值]×100%；

相對防效=[處理前病情指數(shù)×(1+對照區(qū)病情指數(shù)增長率)-處理后病情指數(shù)]/處理前病情指數(shù)×(1+對照區(qū)病情指數(shù)增長率)×100%。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2007和SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)用硫酸鏈霉素對煙草青枯病拮抗菌抑菌活性影響

表1 農(nóng)用硫酸鏈霉素與拮抗菌混合液對煙草青枯病菌生長的影響

由表1可知，農(nóng)用硫酸鏈霉素與拮抗菌發(fā)酵液混合液均對煙草青枯病病菌絲生長有一定抑制作用。當V農(nóng)用硫酸鏈霉素∶V拮抗菌發(fā)酵液=3∶2時在第7天對青枯病菌絲生長抑制效果最明顯。且隨農(nóng)用硫酸鏈霉素含量的度降低抑制率降低，在1∶4、0∶5比例下差異水平顯著。

2.2 盆栽試驗測定農(nóng)用硫酸鏈霉素與拮抗菌AKJK-2013-02聯(lián)合抑菌活性

表3 農(nóng)用硫酸鏈霉素與拮抗菌混合液對煙草青枯病的盆栽防治效果

由表3可知，接種煙草青枯病的罹病煙株，在農(nóng)用硫酸鏈霉素與拮抗菌發(fā)酵液混合液的共同作用下煙株發(fā)病率、病情指數(shù)均低于只加入拮抗菌發(fā)酵液的處理組(V農(nóng)用硫酸鏈霉素∶V拮抗菌發(fā)酵液=0∶5)。在煙株灌根處理20 d后，配比為3∶2時煙株發(fā)病率最低為25.03%，病情指數(shù)為17.49%。

3 結(jié)論與討論

通過農(nóng)用硫酸鏈霉素與拮抗菌發(fā)酵液不同量配比下青枯病菌生長狀況的研究發(fā)現(xiàn)：本研究各項比例混合液均對青枯病菌有抑制作用，且抑制效果較明顯。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)：當農(nóng)用硫酸鏈霉素與拮抗菌發(fā)酵液混合比例為3∶2時，抑菌率達到84.7%，抑菌效果顯著。

盆栽試驗表明農(nóng)用硫酸鏈霉素與拮抗菌發(fā)酵液混合液對于發(fā)病煙株有較好防效，煙株病情指數(shù)和發(fā)病率都明顯低于對照(CK)。因此，抗菌素對煙草青枯病拮抗菌發(fā)酵液活性有較積極影響，能增加拮抗菌對青枯病的防效作用。

除抗菌素與生防菌結(jié)合共同防控研究外，今后還需加強農(nóng)用抗生素與化學藥劑、生物肥料，生防菌等進行優(yōu)化復配試驗，為拮抗菌充分利用提高科學依據(jù)。