趙睿驍 韓斐 江明鋒 曾蓮 韓嘉鈺 黃盈 周航

（1. 西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041；2. 西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041；3. 西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用重點實驗室，成都 610041；4. 四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司，成都 610093）

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原的特有物種，主要分布于我國青海、西藏、四川、甘肅西北部和新疆南部［1］，是藏區(qū)牧民的主要經(jīng)濟來源。牦牛肉的干物質(zhì)、蛋白及礦物質(zhì)含量均高于黃牛，且脂肪含量低于黃牛，是一種高蛋白質(zhì)、低脂肪、富含礦物質(zhì)的優(yōu)質(zhì)肉類資源［2］。且因其生長周期長和體型較小，加之高昂的運輸成本，售價遠高于黃牛。高原地區(qū)牧民為提高畜牧業(yè)經(jīng)濟效益，常將黃牛與牦牛進行種間雜交，雜交后代稱為犏牛。其中以黃牛為父本，牦牛為母本的雜交后代為真犏牛；而牦牛為父本，黃牛為母本產(chǎn)生的雜交后代為假犏牛。相較牦牛，犏牛個體更大發(fā)育更快，耕地效率更高，產(chǎn)肉產(chǎn)奶量均優(yōu)于牦牛；而相較黃牛，犏牛具有更好的高原適應性，能夠很好地適應高原惡劣的環(huán)境［3-4］。利用犏牛肉制作肉干也是高原牧區(qū)獲得經(jīng)濟收入的主要方式，對其進行鑒定具有較大的市場需求。

許多不法商家為牟取暴利，利用水牛、黃牛、豬、羊、雞、兔、鴨、狗等肉類制造“牦牛肉干”以假亂真。據(jù)統(tǒng)計，國際市場中假肉干占比15%-39%，而在中國市場假牦牛肉干的比例更是高達80%［5-7］。大量假牦牛肉干的出現(xiàn)，嚴重擾亂了市場，損害了消費者權益。但假牦牛肉干更大的危害是拉低了牦牛肉類產(chǎn)品的市場價格，擾亂了牦牛產(chǎn)業(yè)鏈，減少了藏區(qū)牧民收益。因此，急需要發(fā)展一種適合市場和基層使用，結果判定較為簡單的方法對牦牛和犏牛肉干進行鑒定。

目前，常用的肉類鑒定方法有蛋白質(zhì)鑒定和DNA 鑒定兩類?；诘鞍踪|(zhì)特性的鑒定方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-1inked immunosorbnent assay，ELISA）和近紅外光譜（Near infrared reflectance，NIR）分析等［8-10］。蛋白分析操作相對簡便，但分析混合樣品難度較大。且加工烹調(diào)會使肉制品失去原有蛋白特性，導致這類方法將無法鑒定肉源成分。因此，基于蛋白質(zhì)特性的鑒定方法存在一定的局限性。基于DNA 序列特異性鑒定的方法主要有普通PCR［11-12］、限制性片段長度多態(tài) 性PCR（Restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）［6，13］、高分辨率熔解（High-resolution melting，HRM）分析［14-15］、熒光定量PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）［16-19］。這些方法靈敏度高，特異性強，且DNA 分子結構相對穩(wěn)定，加工處理的肉制品中也能提取出小片DNA，彌補了蛋白質(zhì)鑒定方法的不足。但這些要實現(xiàn)高通量鑒定，步驟較為繁瑣。多重PCR 能在一個體系中同時擴增多條DNA 片段，可根據(jù)擴增片段大小同時鑒定多種物種，克服了以上方法的缺點，且也被廣泛運用于肉源成分鑒定［20-21］。但牦牛與黃牛親緣關系較近，遺傳密碼極為相似［22］，增加了區(qū)分這兩個物種的難度?；趪鴥?nèi)市場以假亂真的現(xiàn)狀，本課題組Lee 等，根據(jù)不同物種在線粒體12S rRNA 上的特異性變異位點，成功設計出了9 對特異性引物，利用多重PCR 技術，對水牛、黃牛、豬、羊、雞、兔、鴨、狗、牦牛9 個物種進行鑒定［23］。該方法操作難度高，結果讀取較復雜，不適于全面推廣，且未包含犏牛鑒定方法。

PCR-膜芯片技術是使用多重PCR 擴增靶序列，并在尼龍膜上與固化了生物素標記的特異性探針進行雜交，一次雜交即可同時篩查被檢DNA 中的多種突變。該方法已廣泛運用于病原體、基因突變和基因分型的檢測［24-26］。目前研究顯示，PCR-膜芯片技術可實現(xiàn)多種動物源性成分的鑒定，且該方法快捷準確，操作要求不高［27-28］。但在目前較少應用于物種鑒定。因此，本研究擬在PCR-膜芯片技術的基礎上，以期建立包括牦牛及犏牛在內(nèi)的11 種動物源肉制品的鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 雞、鴨、兔、豬、黃牛鮮肉樣品各8 份購自成都市洗面橋街農(nóng)貿(mào)市場，牦牛與犏牛樣品各8 份分別采自紅原及香格里拉屠宰場，國內(nèi)品牌購于淘寶網(wǎng)站，散裝肉干樣品共19 個購于成都市武侯大街某特產(chǎn)批發(fā)市場。

1.1.2 主要試劑 DNA 提取試劑盒（天根）、尼龍膜、SSC、去活化液（100 mmol/L，NaOH）、去活化清洗液（2×SSPE，0.1% SDS）、雜交清洗液（2×SSPE，0.5% SDS）、孵育液（堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素按1∶2000 的比例加入到999.5 μL 的孵育液中）、孵育清洗液1（2×SSPE，0.5% SDS）、孵育清洗液2（0.3 mol/L NaCl、20 mmol/L NaH2PO4、20 mmol/L EDTA· Na2，其pH 為7.4）、顯色液（BCIP/NBT、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑蘭）、PCR 引物及探針（上海生工合成并純化）、PCR Master Buffer（100 mmol/L tris-HCl，15 mmol/L MgCl2， 其pH 為8.0）、dNTP、Taq Polymerase（擎科）。

1.2 方法

1.2.1 PCR 引物及探針設計 根據(jù)物種特異性基因片段，豬的線粒體細胞色素氧化酶亞基基因（Cytochrome oxidase subunit I，COX）、山羊的線粒體細胞色素b 基因（Cytochrome b，cyt b）［28］、其他物種的線粒體12S rRNA 設計引物和探針，以actin基因作為內(nèi)參基因。引物和探針的設計由Primer Premier 5.0 軟件完成。根據(jù)膜基因芯片雜交原理，反向引物 5′端以生物素標記，探針 5′端以Aminolinker（C6）修飾。引物和探針序列見表1。

1.2.2 樣品處理與DNA 提取 去除肉干樣品中的油脂和雜質(zhì)等添加劑，稱取大約50 mg 肉樣，已知鮮肉樣品按物種名編號，肉干樣品以S01-S21 編號。使用DNA 提取試劑盒提取并純化DNA。

1.2.3 多重PCR 以待測樣品DNA 為模板，在20 μL 體系中加入Mix 酶10 μL、正向引物（20 μmol/L）0.5 μL、反向引物（20 μmol/L）0.5 μL、模板DNA 100 ng、ddH2O 8 μL，按以下條件進行擴增：95℃預變性10 min；94℃變性30 s、60℃退火15 s、72℃延伸15 s、33 個循環(huán)；72℃延伸3 min。得到多重PCR 產(chǎn)物。

1.2.4 膜芯片制備 將尼龍膜裁成1.2 cm×1.8 cm的膜條，將裁好的尼龍膜放置于雙蒸水中浸泡15 min，再用15×SSC 浸泡15 min，取出放在濾紙上60℃烘干，待尼龍膜降溫至室溫，按一定順序點上內(nèi)參探針（5 μmol/L）、檢測探針（5 μmol/L）、陽性探針PC（5 μmol/L）以及陰性探針NC（5 μmol/L）（圖1）。

表1 多重PCR 引物信息

1.2.5 雜交顯色 （1）PCR 產(chǎn)物變性：多重PCR產(chǎn)物95℃ 5 min 使其解鏈，放置冰上備用。（2）膜芯片去活化：將制備好的膜芯片放入雜交盒內(nèi)，芯片標簽正面朝上，加入1 mL 去活化液37℃孵育8 min。（3）洗膜：加入1 mL 去活化清洗液60℃洗脫5 min。（4）雜交：將變性后的PCR 產(chǎn)物與1 mL 雜交液充分混勻，放入水平搖床45℃，90 r/min 孵育45 min。（5）洗膜：吸除雜交體系液，加入1 mL 預熱好的雜交清洗液，水平搖床52℃，90 r/min，震蕩清洗5 min，洗滌2 次。（6）孵育：吸除雜交清洗液，加入預熱好的酶孵育液，42℃水平搖床90 r/min，震蕩孵育30 min。（7）洗膜：吸除酶孵育液，加入1 mL 預熱好的孵育清洗液1，42℃水平搖床90 r/min，震蕩清洗5 min，洗滌2 次；吸除孵育清洗液1，加入1 mL 預熱好的孵育清洗液2，37℃水平搖床90 r/min，震蕩清洗5 min，洗滌2 次。（8）顯色：吸除孵育清洗液2，加入1 mL 顯色液，37℃靜置15 min，吸除顯色液，加入1 mL 去離子水37℃洗滌2 次，待膜芯片干燥后進行結果判讀。具體流程如表2所示。

圖1 芯片點樣模式圖

表2 雜交流程表

1.2.6 結果判讀 將已知物種鮮肉樣品通過上述步驟雜交顯色，進行特異性評估；使用TE 將已知物種DNA 樣品稀釋到10 ng、1 ng、0.1 ng、0.01 ng 四個濃度測試膜芯片靈敏度；肉干類樣品也通過上述方法雜交顯色。顯色完成后，膜上內(nèi)參和PC 位點顯色，代表此次實驗結果有效，將顯色位點位置與圖1 相對應即可知道該樣品肉源成分。

2 結果

2.1 特異性評估

分別提取豬、黃牛、山羊、雞、兔、鴨、水牛、牦牛、狗、真犏牛、假犏牛11 種已知樣品DNA，通過多重PCR 擴增，將擴增產(chǎn)物與膜芯片在雜交盒中雜交顯色。結果顯示（圖2）11 個樣品都被準確識別，各陽性雜交點均清晰，無漏檢，多檢現(xiàn)象，結果說明該芯片特異性強，結果準確，可用于鑒定11 種肉類成分。

圖2 特異性評估芯片掃描結果圖

2.2 靈敏度測試

使用TE 將豬、黃牛、山羊、雞、兔、鴨、水牛、牦牛、狗、真犏牛、假犏牛11 種已知樣品DNA 分別稀釋至10 ng、1 ng、0.1 ng、0.01 ng 四個濃度梯度與膜芯片進行雜交，結果顯示（圖3-6），10 ng，1 ng 以及0.1 ng 核酸均能與探針結合，形成清晰顯著的陽性斑點。將核酸稀釋至0.01 ng 時，只有部分物種芯片雜交結果呈弱陽性；豬，黃牛，鴨，牦牛，真犏牛，假犏牛雜交結果均呈陰性。為確定本實驗的準確檢出范圍，我們使用0.1 ng 核酸進行了60 次平行實驗，其檢測結果均為陽性。結果說明膜芯片靈敏度較高，能準確檢測0.1 ng 及以上濃度的微量核酸。

2.3 肉干鑒定

分別將S01-S19 19 個待測樣品DNA 通過多重PCR 擴增，將擴增產(chǎn)物與膜芯片雜交，并根據(jù)陽性斑點位置鑒定肉干肉源成分。檢測結果顯示（圖7），樣品S01、S06、S10 為水牛，樣品S02、S03、S04、S05、S07、S08、S09、S11、S14、S15、S16、S18、S19 為黃牛，樣品S12、S13、S17 為牦?；禳S牛。其中S01-S06 為散賣風干牦牛肉干，S07-S19 為袋裝牦牛肉干。結果說明，因散賣牦牛肉干無法確定其商家及廠址，因而摻假比例高達100%，且更偏向于使用口感更差，價格較低的水牛肉造假；而袋裝產(chǎn)品，因其注冊有公司，所以假貨相較散賣產(chǎn)品稍少，即使使用牦牛肉，也混有部分黃牛肉屬于真假摻半型造假。

圖3 靈敏度測試10 ng 核酸芯片掃描結果圖

圖5 靈敏度測試0.1 ng 核酸芯片掃描結果圖

圖4 靈敏度測試1 ng 核酸芯片掃描結果

圖6 靈敏度測試0.01 ng 核酸芯片掃描結果圖

圖7 肉干樣品檢測結果圖

3 討論

青藏高原因其獨特的地理環(huán)境，孕育了許多獨特的物種，牦牛就是其中之一，有“高原之舟”的美譽。同時，牦牛也是藏區(qū)牧民最主要的經(jīng)濟來源。而牦牛肉干更是因其特有的風味口感享譽全球，但是市場大量的摻假牦牛肉干，拉低了牦牛價格，擾亂了牦牛產(chǎn)業(yè)鏈。因此，亟待開發(fā)一種專門針對牦牛肉鑒定的方法，本課題組在此前已研發(fā)的多重PCR 鑒定基礎上開發(fā)出了一種方便快速準確鑒定牦牛及犏牛的方法。

線粒體DNA（mt DNA）分子結構簡單，基因成分相對穩(wěn)定，拷貝數(shù)量大，靈敏度高，進化速度快。同時，其具有較高的種間多樣性以及較低的種內(nèi)變異。雖然黃牛與牦牛12S rRNA 序列具有極高的相似性，但通過比對發(fā)現(xiàn)，牦牛mtDNA 第1168位點特異性的插入有T 堿基，且其他物種12S rRNA內(nèi)也同樣存在特異性位點。因此，根據(jù)各物種12S rRNA 序列上的特異位點設計引物，用以區(qū)分各物種。由于鑒定物種種類較多，為了減小引物競爭，避免形成引物二聚體，我們將2 對通用引物作為上游引物；同時為了提高PCR 產(chǎn)物與探針的特異性雜交效果，我們根據(jù)豬的線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ基因（Cy-tochrome oxidase subunit I，COX I）及山羊線粒體細胞色素b 基因（cytochrome b，cyt b）重新設計了2 對引物，替換了豬和山羊的12S rRNA 引物。

本課題組在多重PCR 的基礎上進行了改進，將多重PCR 與膜芯片相結合，利用反向斑點雜交技術增加了結果的可視性，直接讀取陽性雜交斑點即可識別檢測樣品物種，特別適合基層單位使用本技術進行鑒定。由于之前的設計使用了通用引物，不可避免的產(chǎn)生了一些非特異性產(chǎn)物，而將多重PCR 產(chǎn)物與探針雜交，避免了非特異性引物對結果讀取的影響。我們的多重PCR 引物是根據(jù)各物種線粒體12S rRNA 設計，能夠很好地將牦牛與其他物種區(qū)分。但由于線粒體為母系遺傳，故真犏牛線粒體與母本牦牛一致，假犏牛線粒體與母本黃牛一致。因此，使用此方法會將真犏牛誤判為牦牛，而將假犏牛誤判為黃牛從而導致誤判。為規(guī)避這個問題，我們在探針上做了調(diào)整，雖然犏牛線粒體遺傳于母本，但是常染色體卻是來自母本和父本雙方。我們通過比對牦牛和黃牛核基因ZNF280B的差異，根據(jù)其特異序列額外設計了一對特異引物，并根據(jù)擴增出的特異片段增加了牦牛ZNF280B和黃牛ZNF280B兩個探針。若牦牛線粒體呈陽性，黃牛ZNF80B呈陽性，牦牛ZNF80B為陰性或陽性，則為真犏牛；若黃牛線粒體呈陽性，牦牛ZNF80B呈陽性，黃牛ZNF80B為陰性或陽性，則為假犏牛。經(jīng)過實驗驗證，該方法成功解決了犏牛誤判的問題。

4 結論

通過對膜芯片特異性的評估和靈敏度的測試，充分說明PCR-膜芯片技術具有特異性強，靈敏度高的特性。利用PCR-膜芯片技術能夠快速，準確的鑒定樣品肉類物種。而通過對市場上售賣的牦牛肉干的鑒定，檢測結果與文獻報道相符，80%以上產(chǎn)品均為假牦牛肉干。因此，PCR-膜芯片快速鑒定牦牛及犏牛技術的推廣能打擊牦牛及犏牛肉干制假現(xiàn)象，保護消費者的權益。同時，對假牦牛肉干的打擊有利于抬高牦牛肉售價，保護我國獨特的肉類資源，恢復被擾亂的牦牛產(chǎn)業(yè)鏈。