楊麗娟 李世訪 盧美光

（中國農業(yè)科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

microRNA（miRNA）是一類在真核生物體內普遍存在的，長度在22 nt 左右的單鏈小RNA 分子，自身不具有開放閱讀框（Open reading frane，ORF），屬于非編碼RNA［1］。miRNA 能形成具有分子莖環(huán)結構的前體。植物中前體大小變化范圍較大，可以從幾十到數(shù)百個核苷酸，而在動物中前體大小變化范圍較小，一般在60-80 nt。植物miRNA 基因位于基因間區(qū)域或者基因內含子區(qū)域，有些miRNA 基因相互之間距離很近，從而形成基因簇，他們可以共同轉錄一個初級miRNA［2］。隨著對miRNA 研究的不斷深入，研究人員已經鑒定出大量的miRNA。目前，miRNA 數(shù)據(jù)庫（miRBase v22.0）中收錄了動物、植物、藻類等271 個物種，38589 條發(fā)夾前體miRNA 和48860 條成熟miRNA 的相關信息［3］。其中，研究者從擬南芥、番茄、玉米、水稻、蘋果、桃等植物中鑒定了大量的miRNA，部分miRNA 被證實參與了植物的生長發(fā)育、器官分化、激素應答、信號轉導等生物學過程［4-7］。例如，miRNA156、miRNA165 和miRNA319 參與植物葉片的發(fā)育和形成［8］；miRNA172、miRNA159 參 與 花 的 發(fā) 育［9］；miRNA390、miRNA393、miRNA166、miRNA167 等參與植物激素信號通路［10］。除此之外，植物在生長過程中會遇到許多生物與非生物的脅迫，包括病原（細菌、真菌和病毒等）的侵染，植物通過某些miRNA 的生成與表達來調控編碼基因的表達，并通過基因與基因間的相互作用，最終抵抗逆境脅迫［11-14］。本文就miRNA 的作用機制、植物和重要果樹miRNA 參與病原調控方面的研究進展進行了概述，旨在為miRNA 在作物抗病防御方面的深入研究和應用提供理論依據(jù)。

1 miRNA 作用機制

miRNA 可以通過基因剪切或翻譯抑制等方式來調控靶基因，精準控制其表達水平［15］。目前的研究表明，miRNA 可通過3 種機制介導基因沉默：一是miRNA 對靶mRNA 的直接剪切；二是miRNA 結合靶mRNA，抑制編碼基因的翻譯；三是在轉錄水平的另一種調控方式，即miRNA 靶向靶DNA，在轉錄水平沉默基因的表達［16］。miRNA 對靶基因的調控方式取決于miRNA 和靶基因的互補程度。其中，植物中的miRNA 主要以剪切mRNA 的方式調控靶基因的表達［17］。

在miRNA 與其靶mRNA 幾乎完全互補的情況下，miRNA 則介導mRNA 特異性切割。miRNA 進入細胞質后，能夠被裝載進AGO 蛋白并形成沉默復合體，其中的miRNA 能指導沉默復合體識別特異的mRNA 位點，隨后，AGO 蛋白在配對的miRNA 的第10-11 位堿基處切割mRNA。這種調控方式不僅可以影響mRNA 的表達水平，也影響蛋白的表達水平。在這種調控機制中，miRNA 與靶基因呈現(xiàn)高度配對，錯配數(shù)較少［18］。

當miRNA 與靶基因之間的錯配數(shù)較多時，miRNA 更傾向于與mRNA 結合但不進行切割，這種方式不會影響mRNA 的表達水平，但能使得其靶基因的蛋白翻譯過程受阻，但目前這種調控方式的詳細機制尚未明確［19］。

在水稻中，存在一類由DCL3 加工形成的長鏈miRNA（long miRNAs，lmiRNAs），這種長鏈miRNA可以裝配到AGO4 蛋白并進入細胞核中，介導靶基因位點的DNA 甲基化。另外，miRNA 還可以剪切內含子并產生phased siRNA（phasiRNA），這些phasiRNA 可能會與AGO4 結合并進入細胞核中介導靶基因的DNA 甲基化［20］。

2 miRNA 與植物病原侵染

近年，miRNA 響應非生物脅迫（干旱、冷熱脅迫、鹽堿等）的相關研究較多［21-23］；而生物脅迫和病原侵染等導致的miRNA 響應研究結果相對較少。有研究報道，miRNA 作為一種重要的轉錄調控因子參與了多種抗病相關基因的表達調控，例如，miRNA可以通過調控植物病原物的相關分子模式觸發(fā)的免疫反應和效應因子觸發(fā)的免疫反應，其作用靶標以NBS-LRR 類抗病基因居多［24］。miR159a、miR172a、miR172b、miR845a 在擬南芥等多種植物中參與了抗病反應，并誘導細胞的程序性死亡［25］。Zhang 等［26］通過對70 種陸生植物的抗病基因與大量的miRNA數(shù)據(jù)的耦合分析，提出了植物miRNA 和抗病基因共演化模型，研究表明，不同的miRNA 通過靶向抗病基因的保守結構域，對抗病基因的表達進行調控。隨著高通量測序技術和生物信息學分析技術的不斷發(fā)展（表1），在玉米、水稻、擬南芥、大豆、葡萄、蘋果、番茄等植物中，越來越多的miRNA 被發(fā)現(xiàn)，這些miRNA 廣泛參與植物細菌、真菌和病毒等病原侵染的調控。

2.1 miRNA與植物真菌侵染

miRNA 可參與植物對真菌的系統(tǒng)防御，Lu 等［27］發(fā)現(xiàn)火炬松感染梭型櫟柱銹菌后，來自miR156、miR159、miR319 等10 個家族 的miRNA 在莖干中顯著下調表達。雖然這些miRNAs 在根和感染部位上部的莖中無明顯變化，但其靶基因的表達量出現(xiàn)了明顯的上升，這表明在該病菌侵染后，寄主可能在未感染部分產生了免疫反應，引發(fā)了寄主的防御反應。毛楊果被葡萄座腔菌感染后，來自miR172、miR319、miR398、miR408、miR1448 等12 個miRNA 家族的41 個miRNA 的表達量上調，它們的靶基因包括植物抗病蛋白，過氧化物酶，細胞分裂素氧化酶編碼基因、MYB、ARF等，涉及多種生物學途徑。對靶基因的分析結果顯示，CKX、CSD、POD等靶基因的表達量在真菌處理后出現(xiàn)不同程度的下調［28］。zma-miR393 能響應玉米紋枯病菌的侵染，它通過調控靶基因TIR1的表達量，調節(jié)生長素信號轉導途徑，進而對真菌侵染作出響應［29］。劉震［30］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 表達豐度的提高與玉米抗病性相關，共鑒定到46 個抗病相關的miRNA，其靶基因編碼WRKY 轉錄調控因子，紅素氧還蛋白，AMC1 凋亡蛋白，肉桂酸-4-氫化酶，BAX 抑制子等均與抗病相關。實驗通過RT-qPCR 技術驗證了zmamiR393 與 生 長 素 受 體F-box2（AFB2），PC732 與凋亡蛋白、PC169 和硫氧還蛋白之間的相互關系和調控方式，并分析了PC123、PC169 這兩種miRNA及其靶基因在抗、感病品種中的表達情況。據(jù)實驗結果推斷，PC732 和PC169 可能分別通過調控凋亡蛋白和硫氧還蛋白來抵御新月彎孢菌的侵染。研究表明，與水稻-稻瘟病菌互作相關的miRl60a 和miR398b 的靶基因表達與相應miRNA 累積量呈負相關性，過表達miRl60a 和miR398b 的轉基因水稻對稻瘟病的抗性明顯增強［31］。

2.2 miRNA與植物細菌侵染

miRNA393 是最早報道的參與植物病原相關分子模式觸發(fā)的免疫反應的miRNA。對紫丁香假單胞菌侵染擬南芥的miRNA 研究表明，與miRNA393 過表達植株相比，野生型植株中細菌效價高5 倍，且miRNA393 可以被flg22 誘導表達，并通過靶向生長素受體基因TIR1、AFB2、AFB3，負向調節(jié)植物生長素，在植物抵御細菌侵染方面有重要作用［32］。Ehya 等［33］發(fā)現(xiàn)，‘Candidatusphyplasma aurantifolia’侵染墨西哥檸檬樹后，在檸檬樹內檢測到較高水平的生長素，并且檸檬樹內miRNA159、miRNA160、miRNA166、miRNA167 表達量也出現(xiàn)明顯變化，它們的靶基因對應ARF、MYB，均在植物激素代謝途徑中發(fā)揮重要作用。擬南芥中，細菌鞭毛蛋白縮氨酸肽段可引起miRNA156、miRNA160、miRNA398、miRNA391 等多種miRNA 及其靶基因表達量的變化，miRNA 通過調控靶基因參與生長素信號轉導、活性氧代謝和DNA 甲基化等途徑，對flg22 進行響應調控。該實驗結果表明，miRNA 響應細菌侵染是一個復雜的過程，涉及多種生物學過程［34］。Dunoyer 等［35］發(fā)現(xiàn)，當煙草受到可致瘤的農桿菌感染時，煙草內miRNA393 的表達量下調，而當這些農桿菌無致瘤作用時，其表達量不會發(fā)生變化。其研究證明，農桿菌可通過下調miR393 的表達量來促進寄主生長素信號途徑，從而起到抑制根瘤的生長的作用。

2.3 miRNA與植物病毒侵染

目前，許多研究表明miRNA 與病毒介導的病害，以及病毒誘導的基因沉默相關。Bazzini 等［36］發(fā)現(xiàn)，煙草花葉病毒屬、馬鈴薯Y 病毒科和甲型線形病毒科的植物病毒感染煙草后會影響miRNA166、miRNA169、miRNA171 等多種miRNA 的積累。另有研究表明，即便在不影響轉錄后基因沉默的情況下，病毒的侵染和病毒編碼的蛋白也會打破寄主體內miRNA 的平衡狀態(tài)，說明病毒的致病性與寄主體內的miRNA 通路過程息息相關。2017 年，吳建國等［37］通過構建水稻miRNA528 突變株，miRNA528過表達株，以及表達miRNA528com 結構的轉基因植株，檢測這些水稻株系在水稻條紋病毒（RSV）侵染之后的病害發(fā)展情況以及病毒CP 基因相對表達量，結果表明：水稻miRNA528 參與RSV 侵染過程，miR528 表達水平的調控有助于維持野生型水稻植株對RSV 的基礎抗性。Kasschau 等［38］通過在擬南芥中過表達病毒HC-Pro 基因，使得miR171 表達水平降低，其多數(shù)靶mRNA 水平提高，植物出現(xiàn)受病毒介導的相關病癥。Qu 等［39］人工設計了一種靶向黃瓜花葉病毒（CMV）病毒沉默抑制因子2b的miRNA，轉入煙草，發(fā)現(xiàn)其在瞬時表達系統(tǒng)中能有效的抑制2b 基因的表達，賦予了轉基因煙草對CMV 的抗性。研究者以擬南芥的miR159 前體為骨架直接合成amiRNA（artificial miRNA），它靶向了2個基因沉默抑制子，分別是蕪菁黃花葉病毒（TYMV）的P69 以及蕪菁花葉病毒（TuMV）的HC-Pro，分別過表達amiR-P69159 和amiR-HC-Pro159 的轉基因擬南芥呈現(xiàn)出特異性抗TYMV 和TuMV 的表型，這兩種人工miRNA 的過表達轉基因植株對TYMV 和TuMV 的侵染均表現(xiàn)出抗性［40］。Lin 等［41］在擬南芥中對人工miRNA 的21 個核苷酸位置的影響進行研究，并將其中核苷酸位置分為3 個等級，當核苷酸突變發(fā)生在重要位置時，寄主的抗病性喪失80%，突變發(fā)生在中度位置時抗病性喪失為36%，其余位置抗病性喪失為7%。奧云朝倫［42］研究發(fā)現(xiàn)，在大豆花葉病毒（SMV）侵染大豆之后，大豆中miR168a，miR162b，miR1515a 等幾種miRNA 表達量下調。通過對SMV 侵染后的miRNA 及其靶基因的實時表達情況分析，對miRNA 過表達與寄主內SMV 濃度的對應關系分析表明，SMV 通過誘導相應miRNA 的積累，下調RNAi 通路基因和NBS-LRR 家族抗病基因的表達，從而抑制大豆的防御反應。

表1 部分植物中響應病原侵染的miRNA 總結

3 重要果樹病原反應相關miRNA 研究

中國是世界上最大的水果生產國，其中，蘋果、柑橘、桃、葡萄和梨等是我國重要的果樹。但在果樹大面積栽培中，會受到包括真菌，細菌和病毒等果樹病原的侵染，嚴重影響果品的產量和質量。其中一些病原菌的脅迫可能是毀滅性的［43］，如柑橘黃龍病等，還有一些病原菌會給果樹生產帶來嚴重的經濟損失，如葡萄霜霉病（Plasmopara viticola）是一種世界性病害，霜霉病菌可侵染葡萄葉、莖和果實，影響葡萄生產的產量［44］。如前所述，近年來，隨著測序技術和生物信息技術的飛速發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)，植物miRNA 不僅參與調控植物的生長發(fā)育，而且在調節(jié)植物免疫應答方面也具有重要作用。miRNA 作為一種重要的轉錄后調控小分子，對其在響應和抵御果樹病原脅迫方面的研究，明確寄主miRNA 響應脅迫的調控機制，對果樹病害防控具有重要意義。

盡管相比于擬南芥、番茄、玉米、水稻等模式植物和大田作物，果樹miRNA 的研究進展相對緩慢，但果樹作為我國的重要經濟支柱產業(yè)，對其miRNA 的研究越來越多，據(jù)miRBase v22.0 數(shù)據(jù)庫釋放數(shù)據(jù)，目前包含了蘋果、桃、葡萄、梨、柑橘和草莓等十幾種果樹近1800 條成熟miRNA。近年，果樹miRNA 的研究主要集中在miRNA 的鑒定及靶基因預測分析。例如，在歐亞種葡萄中鑒定出146 中miRNA 及對應的靶基因［45］，在寒富蘋果和桃“Lovell”中分別預測到154 個和110 個miRNA［46-47］。在“鴨梨”中預測到299 個miRNA，其中276 個屬于27 個保守miRNA 家族，新miRNA有23 個，預測的靶基因多為植物轉錄因子、抗逆抗病響應、植物激素信號轉導等途徑的相關因子［48］。Barakat 等［49］對桃芽的sRNA 測序發(fā)現(xiàn)了387 種保守和非保守的miRNA，發(fā)現(xiàn)miRNA156，miRNA172，miRNA398 等響應冷脅迫。Eldem 等［50］發(fā) 現(xiàn)miR160、miR165/166、miR167，miR395 響 應干旱脅迫。Pekmezci 等［51］在桃中發(fā)現(xiàn)了一些與轉座子相關的miRNA 能夠響應干旱脅迫。冷翔鵬［52］研究了miR398、miR159、miR164 等8 個響應銅脅迫的葡萄miRNA 的表達模式，其中，miR398 的表達下調最為顯著，miR398 能介導葡萄CSD2 裂解，且在煙草中過表達葡萄CSD2 能提高植株耐銅性。在miRNA 參與果樹抗病響應方面，研究發(fā)現(xiàn)，葡萄中miRNA171b、NewmiRNA2118 等可通過負調控抗病蛋白RPP13 來響應白粉病菌的侵染［53］，蘋果中miRNA167a、miRNA395a 等可對蘋果輪紋病脅迫作出響應［54］，桃屬植物miRNA 靶基因中包含多個編碼病毒抗性蛋白的基因，對其抗病性具有重要的調控作用［55］。這里，我們主要對我國重要經濟價值的蘋果、桃、葡萄和梨的相關響應果樹病原侵染的miRNA 研究進展進行了總結，與其為果樹病原與寄主互作機制的深入研究提供新的思路。

梨樹中，劉娟［56］通過sRNA 高通量測序發(fā)掘不同溫度處理條件下被蘋果莖溝病毒感染的沙梨組織部位miRNAs 數(shù)據(jù)，共鑒定了144 個新的miRNA，77 個miRNA 為熱處理條件下表達差異顯著，其中64 個差異表達miRNA 預測到693 個靶標基因，其靶基因涉及代謝，刺激反應，激素信號轉導途徑，以及抗病防衛(wèi)等多種生化過程。研究發(fā)現(xiàn)，熱處理條件下，梨寄主miRNA 表達模式具有組織特異性，且蘋果莖溝病毒 CP 基因在梨莖尖和基部表達量均降低，結果顯示miRNA 可通過對其靶基因的調控作用降低梨樹中的病毒濃度。桃作為薔薇科研究的模式植物，其基因組測序已經在2010 年完成，桃miRNAs 最初是通過計算機預測大量數(shù)據(jù)庫中的EST 序列獲得［57］，隨著新一代高通量測序技術的發(fā)展，鑒定到桃屬miRNA 的靶基因包含多個病毒性抗性蛋白 NBS-LRR 基因，推測這些miRNA 與植物抗病特性有關［55］。葡萄在果樹類研究中處于領先地位，它是第一個完成基因組測序的果樹，通過“黑比諾”葡萄構建的基因組草圖為在葡萄中挖掘miRNAs 序列奠定了良好的基礎［58］。張穎等［59］研究發(fā)現(xiàn)，葡萄白腐病菌侵染葡萄后，44 個miRNA的表達在“刺葡萄”和“美人指”間存在差異，其中miRNA159a，miR172a、miR172b、miR845a、novel_81 這5 個miRNA 在“刺葡萄”中特異表達，靶基因功能中包括了糖代謝、能量代謝，與抗病直接相關的基因。韓麗娟等［53］在中國野生華東葡萄“白河-35-1”篩選出14 個與抗白粉病相關的miRNA，對應36 個靶基因。在葡萄植株感染白 粉 病 后， 發(fā) 現(xiàn)miRNA171b、NewmiRNA2118、NewmiRNA535、NewmiRNA27 都有明顯的下調趨勢，通過表達模式分析發(fā)現(xiàn)該miRNA 可以負調控抗病蛋白RPP13。方輝等［60］利用生物信息學技術對葡萄vvi-miR169 基因家族的序列分布、定位特征、二級結構、發(fā)育進化樹和靶基因調控功能進行生物信息學分析。研究結果表明，vvi-miR169 基因家族共預測到21 個靶基因，其中多個miRNA 靶基因均含有NF-YA 轉錄因子，vvi-miR169 基因家族序列保守性較高，家族特征明顯，且具有相似的調控功能，NF-YA 轉錄因子是vvi-miR169 基因家族最主要的靶基因，也是葡萄生長發(fā)育過程中抗逆境脅迫的主要調控元件。蘋果樹中，Ma 等［61］通過生物信息學分析和構建“金冠蘋果”sRNA 文庫的方法鑒定出146種miRNA，預測到一種新型miRNA（Md-miRLn11）靶向蘋果NBS-LRR 類蛋白編碼基因（Md-NBS），并通過5′RACE 測定證實了Md-miRLn11 具有切割Md-NBS 基因的能力。另外，蘋果葉斑病菌侵入寄主后，Md-NBS 基因在抗病品種中的表達高于敏感品種，而Md-miRLn11 則呈現(xiàn)相反的表達模式，推測Md-miRLn11 可以通過調節(jié)Md-NBS 基因的表達來影響蘋果不同品種對斑點落葉病的抗性。都貝貝［54］利用高通量測序研究了蘋果輪紋病菌侵染的富士蘋果和湖北海棠的miRNA，鑒定了24 個可能與蘋果輪紋病菌侵染相關的miRNA，并用qPCR 檢測了其表達模式。結果顯示，miRNA 的表達在病菌侵染的不同時期呈動態(tài)變化，表達量都在侵染后9 h 和24 h 時顯著增加，研究發(fā)現(xiàn)miRNA167a，miRNA395a，miRNA397a，miRNA827a，miRNA2111a 會對蘋果輪紋病脅迫作出響應，推測其可能對蘋果抗病性產生影響。

4 展望

miRNA 的發(fā)現(xiàn)是RNA 研究領域的一項重大突破，它揭示了非編碼區(qū)提供給宿主的一種調節(jié)機制。miRNA 作為轉錄后調控的重要小RNA 分子，通過與植物mRNAs 的序列互補配對而識別靶基因，降解靶mRNA 或抑制基因翻譯，最終抑制目的基因表達［62］，參與植物生長發(fā)育，激素信號轉導、生物和非生物脅迫等過程的調控。然而就目前而言，其研究主要集中在擬南芥、煙草、水稻、小麥、大豆和玉米等模式作物和大田作物上，在果樹上的研究相對較少，大多集中在對miRNA 的鑒定和靶基因的預測，研究表明，多數(shù)miRNA 在植物和果樹中是保守的，鑒定的果樹miRNA 大多屬于已知的MIR 家族，但還有許多保守與非保守以及果樹中特異miRNA 有待鑒定和發(fā)現(xiàn)。相比于模式作物和草本植物，果樹生長周期長、遺傳機制復雜，獲得轉基因植株難度大，因此，對于參與果樹生長發(fā)育和抵抗脅迫的miRNA的挖掘和研究有待進一步推進。

盡管目前對植物miRNA 的研究有較大突破，在miRNA 鑒定和靶基因預測，對植物生長，抗逆脅迫等方面有許多研究進展，但仍然有些問題需要解決［63-64］：（1）特異性miRNA 的合成和活性調控機制；（2）miRNA 是如何選擇對靶標基因進行抑制表達還是基因剪切的；（3）現(xiàn)行的miRNA 靶標基因的預測主要通過堿基互補配對原則，具有較大的局限性；（4）miRNA 的起源及在生物進化中的意義；（5）miRNA 在調節(jié)基因過程中存在多重交叉調控機制?；谶@些問題，目前，對植物miRNA 的功能研究仍然十分有限，相對于全部miRNAs，只發(fā)現(xiàn)了其中一小部分的miRNAs 的功能。

未來，對miRNA 參與其靶基因調控機制，植物抗病相關miRNA 的功能鑒定，將成為miRNA 研究的重要課題。RNAi 介導的基因工程推動了作物育種及植物抗逆的研究，而miRNA 的發(fā)現(xiàn)補充和完善了人們對之前植物防御等基因調控途徑的理解［65］，研究人員可以從miRNA 的代謝調控方面來操縱植物中各類基因的表達，并發(fā)展了有效沉默靶基因的一種新方法，即人工合成miRNA（artificial miRNA，amiRNA）技術［66］，amiRNA 技術將進一步推動植物抗逆及育種研究的發(fā)展。對miRNA 的人工操控可為miRNA 在作物生長發(fā)育，作物育種，抗病防御，抗逆調控等方面的利用提供重要的理論依據(jù)。