杜全能 朱文娟 蘭時(shí)樂(lè)

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

隨著集約化、規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖廢水中殘餌、糞便的增加導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化加劇。氮元素作為養(yǎng)殖水體中的污染物，主要以氨氮（NH4+-N）、亞硝氮硝氮的形式存在。氨氮亞硝氮的存在對(duì)水生動(dòng)物存在一定的危害。氨氮對(duì)水生動(dòng)物的鰓Na+/K+-ATP酶［1］、組織結(jié)構(gòu)［2-3］、血清抗氧化系統(tǒng)［4-5］、腸道微生物菌群［6］等均存在影響，同時(shí)亞硝酸鹽氮作為硝化和反硝化過(guò)程中的中間產(chǎn)物，對(duì)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)、免疫指標(biāo)［7］、抗氧化指標(biāo)［8］等也存在較大的影響。嚴(yán)重制約了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，可見(jiàn)養(yǎng)殖廢水中氮的去除變得也更加重要。

目前，在處理養(yǎng)殖廢水中，生物法是最常見(jiàn)、最有效的方法。傳統(tǒng)的生物脫氮，認(rèn)為自養(yǎng)硝化和厭氧反硝化是兩個(gè)獨(dú)立的過(guò)程。由于自養(yǎng)硝化速率低和厭氧反硝化相分離，這種生物處理方法顯得耗時(shí)。自1983 年，Robertson 等［9］發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌以來(lái)，具有該功能的菌群得到廣泛的關(guān)注。近年來(lái)，一些研究發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）［10-12］、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）［13］、克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）［14］具有高效異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的能力。本研究從水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中采集養(yǎng)殖水體污泥樣品，分別以氨氮、亞硝氮和硝態(tài)氮為唯一氮源富集并篩選出一株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的酵母菌DW-1，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、26S rDNA 序列分析，以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建對(duì)菌株DW-1進(jìn)行鑒定，初步探討碳源種類、C/N、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH 值對(duì)該菌在異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的影響，以期為皺褶念珠菌DW-1 在養(yǎng)殖含氮廢水生物處理中的推廣應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種分離樣品 菌種分離樣品取自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東湖水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘污泥，裝入滅菌玻璃廣口瓶中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌種富集和分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）液體種子種子培養(yǎng)基（YPD）：酵母提取粉 10 g、蛋白胨 20 g、葡萄糖 20 g、H2O 1 L。115℃，30 min 滅菌。（2）平板分離培養(yǎng)基：K2HPO47 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、（NH4）2SO40.247 g、FeSO4·7H2O 0.05 g、CH3COONa 3.6 g、H2O 1 L。121℃，25 min 滅菌。（3）BM 培養(yǎng)基：K2HPO47 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、（NH4）2SO40.247 g、FeSO4·7H2O 0.05 g、CH3COONa 3.6 g、H2O 1 L。121℃，25 min 滅菌。（4）反硝化培養(yǎng)基1：K2HPO47 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaNO20.2 g、FeSO4·7H2O 0.05 g、CH3COONa 3.6 g、H2O 1 L。121℃，25 min 滅菌。（5）反硝化培養(yǎng)基2：硝酸鉀10 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、H2O 1 L。121℃、25 min 滅菌。

1.1.3 主要試劑和藥品 K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、FeSO4·7H2O、CH3COONa、NaNO2、KNO3、NaCl、NaOH、磺胺、N-（1-萘基）-乙二胺二鹽酸鹽、磷酸、酒石酸鉀鈉、過(guò)硫酸鉀（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；牛肉膏、蛋白胨（BR，上海盛思生化科技有限公司）；瓊脂（BR，北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 立式恒溫培養(yǎng)箱（ZQPL-200，天津市萊波特瑞儀器設(shè)備有限公司）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（ZQLY-180N，上海知楚儀器有限公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（SP-752，上海光譜儀器設(shè)備有限公司）；高壓滅菌鍋（G154DWS，至微儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（LD-9123A，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）；分析天平（AL204，奧豪斯儀器（上海）有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（GR-21G，上海趙迪生物科技有限公司）；DNA 電泳槽（DYCP-31DN，北京六一儀器廠）；穩(wěn)壓電泳儀（DYY-5，北京六一儀器廠）；凝膠成像儀（FR980，上海復(fù)日科技儀器有限公司）；PCR 儀（2720 thermal cycler，Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選分離

1.2.1.1 菌株的富集 取10 g 養(yǎng)殖池塘污泥加入100 mL 的富集培養(yǎng)基中（加入適量的破玻璃珠），置于30℃、170 r/min 搖床中培養(yǎng)72 h。

1.2.1.2 菌株初篩 取 10 mL 富集液加入 90 mL 的無(wú)菌水中振蕩15 min 后，采用 10 倍稀釋法稀釋成10-1-10-8，分別取 0.1 mL 不同梯度的菌懸液涂布于硝化和反硝化固體培養(yǎng)基平板上，倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待固體平板上長(zhǎng)出單菌落后，挑取不同的單菌落進(jìn)行分離純化并編號(hào)。

1.2.1.3 菌株復(fù)篩 將分離純化的菌種分別接種于種子培養(yǎng)基中，于 30℃、170 r/min 培養(yǎng)24 h 后，將種子液按1%（V/V）接種于硝化培養(yǎng)基和反硝化液體培養(yǎng)基1 中，置于30℃、170 r/min 的搖床中振蕩培養(yǎng) 48 h，測(cè)定 NH4+-N、NO2--N 的含量。

大跨度鋼結(jié)構(gòu)玻璃采光頂施工技術(shù)應(yīng)用于本工程，1#～4#樓與6#樓之間為商業(yè)步行街，商業(yè)步行街全部為鋼結(jié)構(gòu)玻璃采光頂，玻璃采光頂有橢圓型和圓弧型兩種組成，投影面積約為1500m2。該玻璃頂短跨為18m、24m，距地面高度為20m。采用此施工技術(shù)玻璃采光頂造型美觀、施工進(jìn)度快、周期短、現(xiàn)場(chǎng)焊接量減少近一半；可以減少施工現(xiàn)場(chǎng)階段對(duì)構(gòu)件的測(cè)控工作，減少對(duì)焊縫的檢測(cè)量，在加工廠焊接，可提高焊接質(zhì)量及精度，是值得推廣的一項(xiàng)施工技術(shù)。本鋼結(jié)構(gòu)玻璃采光頂：整體材料采用矩形管，架體安裝采用分條分塊吊裝的方式。

按 1%（V/V）接種于反硝化培養(yǎng)基2 中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜止培養(yǎng) 24 h 后觀察產(chǎn)氣情況。

1.2.2 菌株形態(tài)觀察 將保存的菌株，在PDA 固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線，并倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24 h 后，觀察其菌落形態(tài)，并進(jìn)行簡(jiǎn)單染色觀察其菌體形態(tài)特征。

1.2.3 菌株的鑒定 用YPD 培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株DW-124 h 后，采用上海生工生物工程DNA 提取試劑盒（SK8257）進(jìn)行DNA 提取。以提取的基因組DNA為模板，擴(kuò)增26S rDNA 基因片段。正向引物序列：NL1：5′- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′，反向引物序列：NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包括10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1 μL、Taq 酶 0.2 μL、正向引物（10 μmol/L）0.5 μL、反向引物（10 μmol/L）0.5 μL，加雙蒸水定容至25 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 4 min，94℃變性 45 s；55℃退火 45 s；72℃延伸 1 min；72℃延伸 10 min；4℃保存。測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。通過(guò)BLAST 程 序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）將26S rDNA 序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，并提交給 GenBank。采用 NJ 法，用MEGA7.0.26 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 菌株DW-1 除氮特性的研究 采用單因素試驗(yàn)法，改變BM 培養(yǎng)基中的碳源種類、C/N、初始pH、溫度、轉(zhuǎn)速等，考察其對(duì)菌株DW-1 脫氮性能的影響。碳源種類：選取蔗糖、丁二酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉分別替代乙酸鈉作為碳源，探究碳源對(duì)菌株DW-1 除氮性能的影響；C/N 比：固定氨氮的濃度為52.29 mg/L，以乙酸鈉作為唯一碳源，分別將C/N 比調(diào)節(jié)為10、15、20、25、30；初始pH值：使用5 mol/L 的HCl 或NaOH 溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH 為2、4、6、8、10；培養(yǎng)溫度：將培養(yǎng)溫度設(shè)置為 20、24、28、32 和 36℃；為：將培養(yǎng)碳源，130 r/min、150 r/min、170 r/min、190 r/min、210 r/min。接種量為1%（V/V），裝量為100 mL /300 mL 三角瓶。重復(fù)3 次。

1.2.5 測(cè)定方法 氨氮、亞硝酸鹽氮、總氮的測(cè)定參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》［15］。氨氮（NH4+-N）測(cè)定采用納氏試劑法、硝酸鹽氮（NO3--N）測(cè)定采用紫外分光光度法、總氮（TN）采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法。

2 結(jié)果

2.1 菌株的分離鑒定

從富集培養(yǎng)基中分離出20 株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的菌株，通過(guò)復(fù)篩和產(chǎn)氣試驗(yàn)，從中篩選出1 株具有對(duì)氨氮和亞硝氮去除率較高的菌株，命名為DW-1。其在PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征為（圖1）：圓形，乳白色，表面濕潤(rùn)，不透明；顯微形態(tài)特征為：橢圓形，出芽生殖，具有典型的酵母菌細(xì)胞特征。經(jīng)26S rDNA 序列分析，菌株DW-1 序列全長(zhǎng)為504 bp，其26S rDNA 序列與Diutina rugosa（登錄號(hào)MG228369.1）有100%的序列相似性（圖2）。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)分析，初步鑒定菌株DW-1 為皺褶念珠菌DW-1（Diutina rugosaDW-1）。

圖1 DW-1 菌株平板菌落形態(tài)特征

圖2 基于26S rDNA 序列同源性構(gòu)建DW-1 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 碳源種類對(duì)菌株DW-1除氮特性的影響

圖3 不同碳源條件下菌株DW-1 除氮特性

2.3 不同C/N對(duì)菌株DW-1除氮特性的影響

探究了5 種不同的C/N 對(duì)菌株硝化和反硝化能力的影響，結(jié)果（圖4）表明，在C/N 為10-30 存在顯著影響（P＜0.05）。隨著C/N 的增加，氨氮和總氮的去除率也隨之增加。當(dāng)C/N 為25：1 時(shí)，氨氮和總氮的去除率最高，分別為88.30%和50.31%。但當(dāng)C/N 大于25：1 后，氨氮和總氮去除率均有所下降。原因?yàn)镃/N 過(guò)低，培養(yǎng)基中氮素含量高，導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)繁殖所需碳素營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)受到限制；而C/N 過(guò)高，培養(yǎng)基中碳素含量高，影響碳素的利用以及改變菌株的代謝途徑甚至抑制細(xì)胞中氨氮加氧酶、羥胺氧化酶、硝酸鹽還原酶或亞硝酸還原酶的活性，從而影響氨氮和總氮的去除。

圖4 不同C/N 條件下菌株DW-1 除氮特性

2.4 不同pH對(duì)菌株DW-1除氮特性的影響

如圖5 所示，不同的pH 值對(duì)菌株DW-1 氨氮和總氮的去除率有顯著影響（P＜0.05）。在pH值為5-8之間，氨氮去除率均高于80%；但培養(yǎng)基pH值高于7，氨氮和總氮去除率均有所下降。當(dāng)培養(yǎng)基pH 值為6.0時(shí)總氮去除率最高，達(dá)到56.79%；而氨氮去除率中最高的pH 值為7.0，達(dá)到88.71%，且pH 對(duì)亞硝酸鹽的積累并無(wú)顯著的影響（P＞0.05）。

圖5 不同pH 值條件下菌株DW-1 除氮特性

2.5 不同溫度對(duì)菌株DW-1除氮特性的影響

溫度對(duì)菌株D. rugosaDW-1 氨氮和總氮去除率存在顯著性差異（P＜0.05）。從圖6 結(jié)果可以看出，菌株DW-1 在20-36℃之間均能去除解氨氮和總氮，且氨氮和總氮去除率隨著溫度的升高而升高。當(dāng)培養(yǎng)溫度為32℃時(shí)，氨氮和總氮去除率分別為89.59%和50.72%。當(dāng)培養(yǎng)溫度超過(guò)32℃后，菌株對(duì)氨氮和總氮的去除率下降。主要原因是由于溫度的升高，游離氨的濃度增加，進(jìn)而提高了硝化和反硝化速率，且溫度對(duì)菌株DW-1 積累亞硝氮無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。

2.6 不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌株DW-1除氮特性的影響

通過(guò)調(diào)節(jié)恒溫振蕩培養(yǎng)箱的轉(zhuǎn)速來(lái)調(diào)節(jié)溶氧量，以探究溶氧對(duì)菌株D. rugosaDW-1 氨氮和總氮去除率的影響。由圖7 結(jié)果可知，轉(zhuǎn)速在130-210 r/min 之間，對(duì)菌株氨氮和總氮去除率均無(wú)顯著影響（P＞0.05），而菌株D. rugosaDW-1 在130 r/min-210 r/min 之間，氨氮去除率在87.29%-95.01%，總氮去除率在45.09%-50.59%，且亞硝酸鹽的積累量均小于0.01 mg/L。

圖6 不同培養(yǎng)溫度條件下菌株DW-1 除氮特性

圖7 不同搖床轉(zhuǎn)速條件下菌株DW-1 除氮特性

3 討論

在碳源試驗(yàn)中，菌株DW-1 只有在乙酸鈉作為唯一碳源時(shí)，才具有較高的異養(yǎng)硝化反硝化能力，這與Acinetobactersp.Y16［10］結(jié)果一致；而當(dāng)蔗糖、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、酒石酸鈉分別作為唯一碳源時(shí)，菌株DW-1 的硝化能力較弱，且均在20%以下，與P. stutzeriHJ-7［16］以檸檬酸鈉為碳源具有最好的脫氮效果，P. putidaYH［17］在琥珀酸鈉作為唯一碳源時(shí)具有最高的脫氮率的試驗(yàn)結(jié)果不同，但與Ren等［11］、Chen 等［12］試驗(yàn)結(jié)論一致?？梢?jiàn)不同的碳源對(duì)異養(yǎng)硝化好氧反硝化細(xì)菌除氮能力存在影響。

菌株DW-1 需要較高的C/N 才能進(jìn)行硝化和反硝化，目前報(bào)道的大多異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌在C/N=10-15 之間，具有最佳的除氮率［13，18］。而Huang 等［10］和Jin 等［19］發(fā)現(xiàn)一些菌株能夠在低碳氮比下進(jìn)行異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用，但本菌株當(dāng)C/N 為25：1 時(shí)，氨氮和總氮的去除率最高。

環(huán)境pH 值和培養(yǎng)溫度也是影響微生物消化和反硝化能力的主要因素。有研究表明，Vibrio diabolicusSF16［20］和Acinetobactersp.T1［12］在pH 值大于7.0 時(shí)氨氮去除率較好，但也有研究發(fā)現(xiàn)有些細(xì)菌只能在微堿性條件下進(jìn)行硝化作用［9］，且大部分菌株均能夠在20-40℃之間進(jìn)行硝化和反硝化作用［21-24］。本研究發(fā)現(xiàn)菌株DW-1 在微酸性、中性、微堿性和培養(yǎng)溫度20-36℃條件下均具有較強(qiáng)的硝化和反硝化能力。

好氧微生物生長(zhǎng)和代謝都需要氧氣，氧氣濃度的高低主要影響微生物細(xì)胞中各種氧化酶系如過(guò)氧化氫酶、多酚氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶等的活力。培養(yǎng)基中氧氣濃度主要通過(guò)提高搖床轉(zhuǎn)速和攪拌速率等實(shí)現(xiàn)。許多研究表明搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株的硝化速率存在顯著性影響（P＜0.05）［10，25-26］，但本研究菌株DW-1 的硝化和反硝化速率與搖床轉(zhuǎn)速無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

4 結(jié)論

本研究在養(yǎng)殖污泥中篩選出一株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的酵母菌，經(jīng)26S rDNA 序列分析結(jié)果，菌株DW-1 與D. rugosa（登錄號(hào)MG228369.1）比對(duì)有100%的序列相似性，確定DW-1 為D. rugosa，并命名為D. rugosaDW-1。在以乙酸鈉為唯一碳源，C/N 為25，pH 值為6、溫度為32℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min 的情況下，菌株DW-1 具有最佳的氨氮降解率和總氮去除率，分別為94.94%、48.69%，而整個(gè)過(guò)程中亞硝氮積累量0.067 mg/L。