吳航 李智強 劉文德

（中國農業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100193）

稻瘟病是由稻瘟病菌引起的一種真菌病害，可導致水稻的大面積減產，產量損失在10%-30%，嚴重發(fā)生時甚至絕收。有研究表明，全球每年因稻瘟病而損失的糧食可以養(yǎng)活大約6000 萬人口［1］。近年來，稻瘟病菌的致病機理已成為研究熱點。對稻瘟病菌侵染結構的研究表明：隔膜蛋白Sep3 的GTPases 通過改變細胞骨架結構形成侵染釘，促進5.9 μm 環(huán)狀結構的形成，環(huán)狀結構和F-actin 共同定位在附著胞孔周圍，導致細胞質膜的彎曲和侵染釘的產生，促進稻瘟病菌的侵染［2］。稻瘟病菌侵染水稻過程中，多種信號傳遞和轉導途徑參與了稻瘟病菌和水稻相互作用，如絲裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivated protein kinase，MAPK）途徑、環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）途徑和鈣離子信號途徑。稻瘟病菌中的MAPK 途徑主要有3 種：Pmk1，Mps1 和Osm1［3-5］。另有研究表明：鈣離子信號途徑參與稻瘟病菌生長、侵染和致病力的形成。例如，受鈣調磷酸酶調控的轉錄因子CRZ1 缺失突變體會導致分生孢子形成率降低和致病力的減弱［6］。cAMP 途徑也參與稻瘟病菌附著胞的形成，腺苷酸環(huán)化酶Mac1基因缺失突變體不能形成附著胞［7］。

在病原物與植物相互作用的分子機制中，由病原物引起的植物防衛(wèi)免疫反應可以分為兩個層次［8-9］。包括模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRRs）識別而引起的免疫防衛(wèi)反應（PAMP-Triggered Immunity，PTI）［10］與 病 原 物 效應蛋白激發(fā)引起的免疫防衛(wèi)反應（Effector triggered immunity，ETI）［11］。在PTI 中，植物的模式識別受體PRRs（如EFR 和 FLS2）識別病原菌的病原相關分子模式PAMPs（如elf18/elf26 和flg22）引起植物一系列生理生化反應，進而增強植物自身抗性［12］。ETI 產生比PTI 更快速和強烈的免疫反應，并引起植物的細胞死亡。例如，水稻的Pi-ta 蛋白C 端的富含亮氨酸區(qū)域（Leucine-rich domain，LRD）和稻瘟病菌的AvrPita ?；灾苯咏Y合，引起Pi-ta 介導的防衛(wèi)反應［13］。稻瘟病菌的效應蛋白AvrPiz-t 抑制RING-finger 類型泛素連接酶APIP6 的泛素化活性，從而抑制PTI 反應［14］。

植物病原物分泌的效應蛋白可以促進病原物的侵染，探究病原菌效應蛋白的結構和進化，明確其在致病過程中的作用，具有重要科學意義。研究表明：細菌通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type Ⅲ secretion system，T3SS）分泌多種效應蛋白進入植物細胞內引起非寄主植物的過敏性反應或寄主植物的抗性反應［15］；真菌的吸器不僅是吸取和交換營養(yǎng)的結構，也是分泌效應蛋白的首要位點［16］；卵菌的吸器不僅是專化性的營養(yǎng)結構，也是效應蛋白的分泌位點［17］。

第一個被克隆的稻瘟病菌效應蛋白Pwl2 是在研究稻瘟病菌侵染彎葉畫眉草（Eragrostis curvula）的過程中被發(fā)現(xiàn)的［18］。Pwl2 同源蛋白Pwl1 同樣可以阻止稻瘟病菌對彎葉畫眉草的侵染［19］。在水稻原生質體中瞬時表達Avr1-CO39 引起Pi-CO39?；赃^敏性反應，表明Pi-CO39 特異識別Avr1-CO39［20-21］。稻瘟病菌MC69基因編碼一個假定的分泌蛋白，MC69缺失的突變體的致病力下降，但對附著胞形成沒有影響。在附著胞形成以后，MC69的缺失突變體不能形成侵染菌絲，因此，效應蛋白MC69在稻瘟病菌致病過程中有重要作用［22］。

對稻瘟病菌分泌效應蛋白的結構、進化和其在致病過程中的作用的研究，可為植物與病原菌協(xié)同進化和植物病害的防治提供理論依據。本研究通過農桿菌介導的瞬時表達系統(tǒng)，篩選到能誘導非寄主植物細胞死亡的稻瘟病菌候選效應蛋白MoCDIE2，對其進行系統(tǒng)生物信息學分析。然后構建MoCDIE2的敲除突變體，并對其生長表型與致病性進行分析，為進一步研究MoCDIE2 的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用煙草材料為本生煙草，水稻材料為感病品種CO39，稻瘟病菌Guy11 菌株，農桿菌Agrobacterium tumefaciens菌株EHA105 均由中國農業(yè)科學院植物保護研究所植物抗病功能基因研究組保存。

1.2 方法

1.2.1 水稻培養(yǎng) 將水稻種子浸泡于盛有水的培養(yǎng)皿中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h 后瀝干，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 催芽至種子破胸露白。將出芽的種子播種到盛有營養(yǎng)土的小方盒里，每盒6-9 粒種子。

1.2.2 煙草注射與瞬時表達 將目的基因的瞬時表達載體電擊轉化到農桿菌EHA105。轉化后的EHA105 菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基，28℃ 210 rpm條件下培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)后的菌液離心，用侵染液［10 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L MES（pH=5.7），200 μmol/L 乙酰丁香酮］重新懸浮菌塊并調整菌液濃度至OD600=1.5。將目的基因的農桿菌菌液與P19菌液（OD600=1.0）等體積混合。室溫條件下黑暗靜置重懸的菌液3 h。使用1 mL 注射器將混合后的菌液注射到生長期為4-5 周的煙草葉片上，注射液浸潤葉片面積為80%，并用記號筆標下注射范圍。

1.2.3 RNA 提取和qRT-PCR 用TRIzol 法提取稻瘟病菌Guy11 的菌絲總RNA，使用RNA 反轉錄試劑盒（Promega 生物公司）獲得cDNA，稀釋cDNA 作為qRT-PCR 模板。qRT-PCR 實驗中使用的PCR 引物（表1）由Primer Premier 5.0 軟件設計，并由北京擎科生物技術有限公司合成。

本實驗使用全式金公司的TranStart Top Green qPCR SuperMix（+Dye Ⅰ）試劑盒進行qRT-PCR反應。反應體系為20 μL，以稻瘟病菌Actin 基因（MGG_03982）為內參基因，并使用ABI Prism7500儀器完成，按照2-ΔΔct計算表達量。

1.2.4 Split PCR 方法構建MoCDIE2基因敲除突變體 根據數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）提供的基因組序列，以稻瘟病菌菌株Guy11的基因組DNA 為模板，MoCDIE2-LBCK/MoCDIE2-LB-R 和MoCDIE2-RBCK/ MoCDIE2-RB-F 為 引 物 進行第一輪PCR 擴增MoCDIE2上下游2 kb 序列LB和RB。以第一輪的PCR 產物的100 倍稀釋液為模板，LB-F/HYG-R1 和RB-R/HYG-F1 為引物擴增LB+HY和YG+RB 片段。將LB+HY 和YG+RB 片段的PCR產物混合后轉化到稻瘟病菌原生質體中。經潮霉素平板抗性壓力篩選得到轉化子，并提取轉化子的DNA 和RNA，進行轉化子的鑒定。

1.2.5MoCDIE2突變體的表型分析 從野生型Guy11 和突變體菌落邊緣打孔取同等大小的圓形菌塊接菌到CM（Complete medium）固體培養(yǎng)基上，28℃條件下黑暗培養(yǎng)7 d 后觀察菌落生長形態(tài)并測量菌落直徑。

1.2.6MoCDIE2突變體致病力檢測 培養(yǎng)稻瘟病菌菌株Guy11 和突變體菌株，25℃條件下持續(xù)光照至產生足夠的孢子數。用0.05%的Tween-20 水溶液洗脫孢子，調整孢子懸浮液濃度至5×104個/mL。將制備的孢子懸浮液均勻噴施在“三葉一心”期的水稻葉片上。噴施結束，用透明薄膜密封黑暗處理24 h，再光照5-7 d 后，統(tǒng)計病害發(fā)生情況。

1.2.7 生物信息學分析 在NCBI 數據庫中進行BLASTP 檢索，獲得19 個與MoCDIE2 高度同源的氨基酸序列，用CLUSTAL W 比對分析，進而用MEGA 7.0 軟件構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果

2.1 MoCDIE2基因的生物信息學分析

在稻瘟病菌中，預測大約有1306 個基因編碼分泌蛋白［23-24］。實驗室前期通過基因組表達譜，MPSS［25-26］，RL-SAGE［27］和SBS［28］3 種 技 術鑒定出851 個稻瘟病菌侵染水稻過程中表達的分泌蛋白［29］。選取其中一個分泌蛋白（MGG_03356，MoCDIE2）作為候選效應蛋白，搜索比對稻瘟病菌全基因組數據庫，發(fā)現(xiàn)MoCDIE2的cDNA 全長為1068 bp，編碼一個含有355 個氨基酸的蓖麻毒素B凝集素蛋白（Ricin B lectin protein）。利用MoCDIE2的氨基酸序列在NCBI 數據庫中進行比對搜索，發(fā)現(xiàn)其在19 個真菌物種中均有同源性較高的蛋白，再利用Clustal W 比對分析MoCDIE2 及其同源性最高的其它19 個蛋白氨基酸序列，最后用MEGA 7.0 構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析MoCDIE2 與其它19 個蛋白氨基酸序列的親緣關系的遠近。同源蛋白對比分析表明：MoCDIE2 與子囊菌門的根腐病菌（Monosporascus ibericus）、炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、痂囊腔菌（Elsinoe australis）的同源性高達82%、80%和75%。在MoCDIE2 的19 個同源性最高的真菌蛋白中，大多來源于子囊真菌，個別屬于擔子菌，如：灰蓋鬼傘菌（Coprinopsis cinerea）和羽瑚菌（Pterula gracilis）（圖1）。這說明MoCDIE2 同源蛋白保守存在于真菌物種中。利用DNAMAN 進行MoCDIE2 和另外4 個絲狀真菌中的同源蛋白氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)：MoCDIE2 在絲狀真菌中具有高度的保守性，并且蛋白氨基酸數目相差不大（圖2）。

2.2 MoCDIE2在煙草中的瞬時表達

圖1 MoCDIE2 和其它物種中同源蛋白的進化樹分析

圖2 MoCDIE2 和其它物種中同源氨基酸序列比對分析

為了篩選能誘導植物細胞死亡的效應蛋白，將MoCDIE2構建到植物瞬時表達載體pGDR 質粒，利用農桿菌介導的轉化系統(tǒng)將MoCDIE2表達載體注射到煙草葉片上進行瞬時表達，同時設置BAX 和空載pGDR 注射的煙草葉片分別作為陽性對照和陰性對照，注射后觀察煙草葉片表型。結果表明：72 h 后，在對照組中，陽性對照BAX 表達載體注射的煙草葉片有嚴重細胞死亡現(xiàn)象，陰性對照pGDR 和P19 表達載體注射的煙草葉片未出現(xiàn)細胞死亡。在實驗組，MoCDIE2 的瞬時表達載體注射72 h 后，煙草葉片發(fā)生明顯皺縮的細胞死亡現(xiàn)象（圖3）。結果表明：MoCDIE2 的瞬時表達能引起非寄主植物煙草葉片的細胞死亡，而細胞死亡是植物限制植物病原物生長的一種防御機制，推測MoCDIE2 可能在植物-植物病原物相互作用過程中起重要作用。

圖3 MoCDIE2 在煙草葉片細胞中的瞬時表達

2.3 MoCDIE2基因敲除突變體的獲得

為構建MoCDIE2敲除突變體，進一步分析其功能，我們利用Split-PCR 方法（圖4-A）擴增MoCDIE2上下游片段和HYG 片段，再利用PEG 介導的原生質體轉化法將LB+HY 和RB+YG 片段混合轉化到稻瘟病菌Guy11 原生質體中，RT-PCR 驗證MoCDIE2敲除轉化子。PCR 結果表明：由LB-F/H YG-R1 擴增得到2488 bp 的LB+HY 的條帶，由RBR/HYG-F1 擴增得到2250 bp 的RB+YG 的條帶（圖4-B）；進一步RT-PCR 驗證，使用引物MoCDIE2-F/MoCDIE2-R 在轉化子2、3、5 和Guy11 中能擴增出條帶，而在陽性轉化子1、4 和6 中不能擴增出條帶（圖4-C），說明成功獲得3 個具有潮霉素抗性的MoCDIE2基因敲除突變體，在后續(xù)實驗中分別命名為MoCDIE2-KO1、MoCDIE2-KO2 和MoCDIE2-KO3。

2.4 MoCDIE2表型鑒定

2.4.1 營養(yǎng)生長 在CM 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)稻瘟病菌的野生型菌株Guy11 和3 個MoCDIE2基因的敲除菌株MoCDIE2-KO1、MoCDIE2-KO2 和MoCDIE2-KO3，一周后觀察菌落形態(tài)發(fā)現(xiàn)：敲除突變體和野生型菌株在CM 平板上的生長速率未見差異，突變體和野生型的菌落形態(tài)無明顯變化（圖5-A）。通過測量野生型Guy11 和MoCDIE2基因的敲除突變體的菌落并進行統(tǒng)計分析的結果表明：突變體和野生型的菌落直徑沒有顯著差異（圖5-B）。因此，MoCDIE2基因可能不直接參與調控稻瘟病菌的營養(yǎng)生長。

2.4.2 致病性測定 將野生型菌株Guy11 和MoCDIE2基因的敲除菌株分別接種到燕麥固體培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)誘導產孢后，將野生型菌株Guy11 和MoCDIE2基因的敲除菌株的孢子懸浮液調整濃度至5×104個/mL，噴霧接種到水稻葉片上，7 d 后觀察水稻葉片的發(fā)病情況、病斑大小和病斑數量等。結果（圖5-C）表明：MoCDIE2的敲除菌株和野生型菌株均能導致接種后的水稻葉片產生典型稻瘟病病斑，且病斑大小和數量沒有明顯的差異。因此，MoCDIE2基因的缺失對稻瘟病菌的致病性沒有影響。

3 討論

在植物和病原物的相互作用中，效應蛋白在促進病原物成功侵染和抑制植物防衛(wèi)反應方面都起重要調控作用［30］。因此采取合適策略分離和克隆效應蛋白對植物病原物的效應蛋白功能研究以及明確病原物與植物之間的相互作用機制有重要意義。

在已被鑒定到的稻瘟病菌效應蛋白中，Pwl1［19］、Pwl2［18］和AvrPiz-t［31］等都是通過圖位克隆策略分離克隆得到。圖位克隆是根據與目的效應蛋白基因緊密連鎖的分子標記在染色體上的位置，通過構建遺傳連鎖群體以及篩選基因組文庫等步驟逐步確定和分離目的基因的方法。圖位克隆策略的優(yōu)點是未知基因的序列信息和基因表達產物的序列、結構等相關信息的條件下，可以獲得該基因。因此，圖位克隆作為一個重要分離克隆未知基因的技術手段，為探索未知效應蛋白的功能提供技術支持。在這一策略中，最重要的因素是開發(fā)與目的效應蛋白基因緊密連鎖的分子標記以及細菌人工染色體（Bacterium artificial chromosome，BAC）或酵母人工染色體（Yeast artificial chromosome，YAC）等基因組文庫的構建。但是傳統(tǒng)的圖位克隆策略實驗周期長，不夠高效，操作步驟繁瑣。在完成了稻瘟病菌全基因組測序的基礎上，借助植物異源表達系統(tǒng)瞬時表達候選效應蛋白為更加快速地克隆目標效應蛋白提供了技術支持。

本研究應用高效的由農桿菌介導的異源表達策略篩選稻瘟病菌效應蛋白。將候選效應蛋白構建到pGDR 表達載體，再利用農桿菌介導的瞬時表達策略快速、有效地初步鑒定效應蛋白的功能。農桿菌介導的轉化系統(tǒng)具有操作簡單，周期短的優(yōu)點。利用生物信息學分析技術結合農桿菌轉化系統(tǒng)，我們成功篩選到一個能誘導植物細胞死亡的效應蛋白，相比較于圖位克隆策略中的周期長、工作量大等缺點，異源表達策略能快速的篩選到誘導非寄主植物細胞死亡的效應蛋白。高效便捷地篩選到誘導植物細胞死亡的效應蛋白，可以為后續(xù)效應蛋白的功能研究奠定基礎，同時提高研究的效率。但如何保證效應蛋白表達載體的順利轉化與穩(wěn)定表達是異源表達策略需要面對的問題。首先，通過制備活性較高的農桿菌感受態(tài)細胞是提高效應蛋白表達載體轉化效率的關鍵之一。其次，煙草植株的選擇也是提高效應蛋白表達載體表達效率的重要因素。在進行瞬時表達的過程中，需要注意植物的生長狀態(tài)，選取健康煙草植株，因為較大或老的煙草葉片不利于效應蛋白表達載體的注射和滲透，從而會導致表達不穩(wěn)定，影響細胞死亡表型的觀察。

圖4 MoCDIE2 敲除突變體的構建與驗證

在本實驗中，能誘導植物細胞死亡的MoCDIE2基因編碼一個蓖麻毒素B 凝集素蛋白。蓖麻毒素蛋白是由A、B 兩條肽鏈通過二硫鍵連接的一種劇毒植物糖蛋白。蓖麻毒素蛋白的A 鏈在B 鏈的協(xié)助下，穿透細胞膜并破壞細胞核蛋白體60S 亞蛋白，從而抑制蛋白質的合成，導致細胞死亡。在蓖麻毒素的B 鏈上有3 個重要的半乳糖結合位點，因此通過特異性抑制B 鏈的結合位點，可能阻斷細胞死亡的發(fā)生。有研究表明：蓖麻毒素能夠誘導小鼠淋巴細胞發(fā)生凋亡而引起細胞死亡，并且檢測到被蓖麻毒素處理后的細胞的線粒體膜電位發(fā)生了顯著變化［32］。因此，MoCDIE2 引起的細胞死亡可能和植物細胞線粒體膜電位的變化有關，在后續(xù)的研究中，可以檢測細胞的線粒體膜電位，進一步明確MoCDIE2 引起的細胞死亡的作用機制。

在本實驗中，與野生型相比，MoCDIE2敲除突變體對稻瘟病菌的營養(yǎng)菌絲生長和對水稻的致病性方面沒有顯著差異，可能是效應蛋白的功能冗余性造成的。其次，MoCDIE2 可能不直接參與調控稻瘟病菌的生長，也不直接參與水稻的致病過程，但MoCDIE2 或許在侵染過程中與其他未知的效應蛋白發(fā)生作用，進而導致某些生理生化過程的發(fā)生。稻瘟病菌中存在著1000 多個分泌蛋白，生物信息學數據表明，大多數分泌蛋白都沒有功能注釋，敲除或過表達某一單個分泌蛋白基因，并不足以影響稻瘟病菌的致病性。這是因為在稻瘟病菌中可能存在其他功能相似的一個或一類基因繼續(xù)行使其功能，從而繼續(xù)保持稻瘟病菌的生長和致病特性，多數功能冗余的效應蛋白存在于稻瘟病菌中，為效應蛋白的功能研究帶來了困難和挑戰(zhàn)。

圖5 稻瘟病菌MoCDIE2 的功能分析

4 結論

本研究通過農桿菌介導的轉化系統(tǒng)篩選到稻瘟病菌的分泌蛋白MoCDIE2（MGG_03356）能誘導非寄主植物煙草細胞死亡。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)：MoCDIE2 編碼一個蓖麻毒素B 凝集素蛋白，在子囊菌門的根腐病菌（M. ibericus）、炭疽病菌（C.gloeosporioides）、痂囊腔菌（E. australis）均存在高度同源蛋白，其同源蛋白也存在于其他16 種絲狀真菌中，并具有高度的保守性。通過Split-PCR 和PEG介導的原生質體轉化系統(tǒng)構建MoCDIE2敲除突變體，獲得了3 個MoCDIE2的敲除突變體。進一步對MoCDIE2功能分析表明：MoCDIE2基因的缺失不影響稻瘟病菌的生長和對水稻的致病性。