姜學(xué)涯，高榮航，梁景文，苑婷婷

(深圳凱吉星農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)認(rèn)證有限公司，廣東 深圳 518000)

黃曲霉毒素B1作為世界公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物質(zhì)之一[1-2]，一般以熱帶和亞熱帶等南方高溫、高濕地區(qū)受污染最為嚴(yán)重[3]，在食品中的檢出率較高[4-6]。因?yàn)辄S曲霉毒素B1耐高溫，280℃才發(fā)生裂解，因此一般烹調(diào)加工溫度下難以破壞其結(jié)構(gòu)，降低其危害。黃曲霉毒素B1毒性作用主要是對(duì)肝臟的損害[7-9]，大量攝入時(shí)，可發(fā)生急性中毒，出現(xiàn)急性肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生。

為保障食品供應(yīng)安全，按照《國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則(2019版)》的要求，黃曲霉毒素B1是食用植物油常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目，結(jié)合GB 2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中4.1.1的要求，植物油脂(花生油、玉米油除外)中限量值為10 μg/kg，其推薦檢測(cè)方法為GB 5009.22—2016。按照GB 5009.22—2016第二法檢測(cè)植物油中黃曲霉毒素B1時(shí)，花生油、大豆油等多種植物油均能達(dá)到良好的去雜效果，但是檢測(cè)菜籽油中黃曲霉毒素B1時(shí)出現(xiàn)了除雜不干凈，從而導(dǎo)致色譜圖中雜峰較多干擾目標(biāo)峰定性及定量的情況[10-16]?？紤]到菜籽油中雜質(zhì)主要為大分子有機(jī)物，本方法采取優(yōu)化萃取溶劑并降低萃取溶劑溫度的方式對(duì)前處理過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，從而降低雜質(zhì)在菜籽油中的溶解度，達(dá)到良好的去雜效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菜籽油、玉米油，購(gòu)于大型超市。黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(2 μg/mL)，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，用甲醇稀釋為0.1 μg/mL儲(chǔ)備溶液。甲醇、乙腈、正己烷，色譜純，美國(guó)J.T.Baker公司；三氟乙酸，分析純。

LC-30A高效液相色譜儀、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱，日本島津公司；Milli-Q純水儀，美國(guó)Millipore公司；Multi Reax振蕩器，德國(guó)Heidolph公司；Supelco固相萃取儀；N-EVAP-45氮吹儀，美國(guó)Organomation；HWS-26水浴鍋；MS3旋渦混勻器，德國(guó)IKA。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

取5 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇-乙腈萃取溶劑(體積比70∶30，此萃取溶劑用之前在4℃的冰箱中放置30 min)，置于渦旋振蕩器中振蕩20 min，在8 000 r/min下離心2 min，取上清液。用移液管準(zhǔn)確吸取4.0 mL上清液于10 mL離心管后，在45℃下用氮?dú)獯抵两?，分別加入200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸，渦旋30 s，在(40±1)℃的恒溫水浴中衍生15 min，衍生結(jié)束后，在45℃下用氮?dú)鈱⒀苌捍抵两?，用初始流?dòng)相定容至1.0 mL，渦旋30 s溶解殘留物，過(guò)0.22 μm濾膜，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

用甲醇作為溶劑，將黃曲霉毒素B1配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.4、1.0、2.0、4.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 高效液相色譜(HPLC)條件

Waters XBridge BEH C18色譜柱(4.6 mm×100 mm，2.5 μm)；流速0.8 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量10 μL；激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm；流動(dòng)相A為蒸餾水，B為乙腈，梯度洗脫，洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 加標(biāo)菜籽油的HPLC譜圖

取同一份空白基質(zhì)菜籽油樣品，加入黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，使菜籽油中黃曲霉毒素B1含量為1.0 ng/mL，分別按照本方法(按1.2.1對(duì)樣品進(jìn)行前處理，檢測(cè)條件按照1.2.3)及GB 5009.22—2016第二法檢測(cè)菜籽油中黃曲霉毒素B1，結(jié)果分別見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 本方法檢測(cè)的加標(biāo)菜籽油的HPLC譜圖

圖2 國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)的加標(biāo)菜籽油的HPLC譜圖

從圖1可以看出，按照本方法檢測(cè)菜籽油中黃曲霉毒素B1時(shí)，HPLC譜圖峰形尖銳，峰型對(duì)稱(chēng)，黃曲霉毒素B1在6.596 min出峰，且有較好的分離效果，能準(zhǔn)確定性及定量。從圖2可以看出，國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)菜籽油中黃曲霉毒素B1時(shí)，HPLC譜圖峰形較寬，由于雜峰掩蓋了黃曲霉毒素B1的目標(biāo)峰，導(dǎo)致假峰的出峰時(shí)間為6.763 min，無(wú)法準(zhǔn)確定性，且基線較高，導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確定量。因此，按照1.2.1對(duì)菜籽油進(jìn)行前處理，采用HPLC檢測(cè)黃曲霉毒素B1時(shí)，能很好地檢測(cè)菜籽油中的黃曲霉毒素B1。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 萃取溶劑對(duì)回收率的影響

在空白菜籽油樣品中分別添加0.1、0.2、0.3 ng/mL 3個(gè)水平的黃曲霉毒素B1，分別采用乙腈-水(體積比84∶16)、甲醇-水(體積比70∶30)、甲醇-乙腈(體積比70∶30)作為萃取溶劑，按照1.2.1前處理方法提取加標(biāo)樣品中的黃曲霉毒素B1，然后用HPLC測(cè)定，每個(gè)添加水平做兩個(gè)平行。計(jì)算黃曲霉毒素B1的平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 萃取溶劑對(duì)回收率的影響

由表2可知,采用甲醇-乙腈(體積比70∶30)提取菜籽油加標(biāo)樣品時(shí)，黃曲霉毒素B1回收率最高，提取效果最好。因此，選擇甲醇-乙腈(體積比70∶30)作為萃取溶劑。

2.2.2 萃取溶劑溫度對(duì)回收率的影響

在空白菜籽油樣品中分別添加0.1、0.2、0.3 ng/mL 3個(gè)水平的黃曲霉毒素B1，萃取溶劑分別在常溫、4℃、-18℃放置30 min，按照1.2.1前處理方法提取加標(biāo)樣品中的黃曲霉毒素B1，然后采用HPLC測(cè)定，每個(gè)添加水平做2個(gè)平行。計(jì)算黃曲霉毒素B1的平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 萃取溶劑溫度對(duì)回收率的影響

由表3可知，萃取溶劑溫度為4℃和-18℃時(shí)，提取效果較好，且二者的回收率差別不大。考慮到檢測(cè)成本，萃取溶劑溫度建議為4℃。

2.2.3 冷藏樣品及冷藏萃取溶劑對(duì)回收率的影響

在空白菜籽油樣品中分別添加0.1、0.2、0.3 ng/mL 3個(gè)水平的黃曲霉毒素B1，分別采用4℃冷藏樣品30 min、4℃冷藏萃取溶劑30 min的方式，按1.2.1前處理方法提取加標(biāo)樣品中的黃曲霉毒素B1，采用HPLC測(cè)定，每個(gè)添加水平做兩個(gè)平行。計(jì)算黃曲霉毒素B1的平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 冷藏樣品及冷藏萃取溶劑對(duì)回收率的影響

由表4可知，冷藏萃取溶劑較冷藏樣品平均回收率更高，因此選擇冷藏萃取溶劑。

2.2.4 萃取溶劑冷藏時(shí)間對(duì)回收率的影響

在空白菜籽油樣品中分別添加0.1、0.2、0.3 ng/mL 3個(gè)水平的黃曲霉毒素B1，萃取溶劑分別4℃冷藏10、30、60、120 min,按照1.2.1前處理方法提取加標(biāo)樣品中的黃曲霉毒素B1，采用HPLC測(cè)定，每個(gè)添加水平做2個(gè)平行。計(jì)算黃曲霉毒素B1的平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 萃取溶劑冷藏時(shí)間對(duì)回收率的影響

由表5可知，萃取溶劑冷藏30 min時(shí)，回收率最高，提取效果最好。因此，選擇4℃冷藏萃取溶劑30 min。

2.3 方法的定量限和線性范圍

利用空白基質(zhì)中加入黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.1進(jìn)行前處理，然后進(jìn)行HPLC測(cè)試并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)信噪比(S/N)大于10得出定量限為0.1 μg/kg，符合GB 5009.22—2016中規(guī)定的定量限(方法定量限為0.1 μg/kg)。本方法的線性方程為y=731.01-18.112x(r=0.999 6)，線性范圍為0.1～4.0 ng/mL。

2.4 方法的回收率與精密度

空白菜籽油樣品中分別添加0.1、0.2、0.5ng/mL 3個(gè)水平的黃曲霉毒素B1，按照1.2.1前處理方法提取加標(biāo)樣品中的黃曲霉毒素B1，然后用HPLC測(cè)定。計(jì)算黃曲霉毒素B1的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 方法的回收率和精密度

由表6可知：空白菜籽油中加入黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，回收率在78.0%～90.4%之間，說(shuō)明該方法回收率良好；RSD在1.61%～4.15%之間，說(shuō)明該方法精密度良好。

2.5 GB 5009.22—2016第二法與本方法對(duì)比

選取一個(gè)空白菜籽油樣品，加入黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按GB 5009.22—2016第二法與本方法(1.2.1方法進(jìn)行前處理后進(jìn)行HPLC測(cè)定)測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)信噪比大于10得出兩個(gè)方法的定量限。稱(chēng)取14個(gè)空白菜籽油樣品并分成兩批，分別添加0.15 ng/mL黃曲霉毒素B1于兩批樣品中，按照GB 5009.22—2016第二法及本方法測(cè)定，計(jì)算兩個(gè)方法的精密度。稱(chēng)取4個(gè)空白菜籽油樣品并分成兩批，添加0.1 ng/mL黃曲霉毒素B1于2個(gè)樣品中，添加0.2 ng/mL黃曲霉毒素B1于另外2個(gè)樣品中，按照GB 5009.22—2016第二法及本方法測(cè)定，計(jì)算兩個(gè)方法的回收率,結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 兩個(gè)方法的定量限、回收率及RSD對(duì)比

由表7可知，國(guó)標(biāo)方法與本方法均可達(dá)到定量限0.1 μg/kg的要求，精密度分別為3.28%和1.95%，回收率分別為83.1%～84.5%和85.4%～88.6%。本方法精密度與回收率稍?xún)?yōu)于國(guó)標(biāo)方法，因此本方法稍?xún)?yōu)于GB 5009.22—2016第二法。

3 結(jié) 論

菜籽油中黃曲霉毒素B1按照GB 5009.22—2016第二法檢測(cè)時(shí)雜質(zhì)較難去除，影響黃曲霉毒素B1定性及定量的準(zhǔn)確性。本文研究確定以甲醇-乙腈(體積比70∶30)作為萃取溶劑，萃取溶劑在4℃預(yù)先放置30 min，對(duì)菜籽油中黃曲霉毒素B1的凈化效果最好。本方法定量限為0.1 μg/kg，線性范圍0.1～4.0 ng/mL，回收率為78.0%～90.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.61%～4.15%。本方法簡(jiǎn)單、快速，能準(zhǔn)確地定性和定量菜籽油中黃曲霉毒素B1。