朱曉俊，卞艷芳，陳 磊，樂(lè)佳敏，胡冬梅

（中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院·上海長(zhǎng)海醫(yī)院，上海 200438）

夜寧糖漿是由女貞子、甘草、靈芝、大棗、合歡皮、首烏藤、浮小麥7 味中藥材經(jīng)煎煮、濃縮等工序制成的中成藥[1-5]，具有養(yǎng)血安神功效，主要用于治療心血不足所致失眠、多夢(mèng)、頭暈、四肢乏力等癥，尤其適用于神經(jīng)衰弱者[6-10]。方中女貞子主要成分為特女貞苷，具有滋補(bǔ)肝腎等功效；甘草主要成分為甘草苷和甘草酸，具有抗抑郁、保護(hù)神經(jīng)等功效[11-14]。2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》中僅有其性狀、鑒別和檢查項(xiàng)目，缺少含量測(cè)定項(xiàng)[15]。本研究中建立了同時(shí)測(cè)定夜寧糖漿中甘草苷、特女貞苷和甘草酸3 種活性成分含量的反相高效液相色譜法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2695 型高效液相色譜儀、2998 型檢測(cè)器（美國(guó)沃特世公司）；XS 205DU 型電子天平（瑞士梅特勒公司）；AS2060B 型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯公司）；Milli-Q Element 型超純水儀（美國(guó)密理博公司）。

1.2 試藥

甘草苷對(duì)照品（批號(hào)為111610-201607），特女貞苷對(duì)照品（批號(hào)為111926-201605），甘草酸對(duì)照品（批號(hào)為110731-201720），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；夜寧糖漿（武漢康樂(lè)藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為20181213，20190104，20190324，規(guī)格為每瓶240 mL）；甲醇、乙腈為色譜純，均購(gòu)于美國(guó)天地公司；試驗(yàn)用水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent Eclipse XDB -C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：229 nm；柱溫：28 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。在此色譜條件下的色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

取甘草苷對(duì)照品、特女貞苷對(duì)照品、甘草酸對(duì)照品適量，精密稱定，加95%甲醇制成每1 mL 溶液中含甘草苷、特女貞苷和甘草酸均為0.5 mg 的混合溶液，即得對(duì)照品貯備溶液。精密量取對(duì)照品貯備溶液適量，制成含甘草苷、特女貞苷和甘草酸質(zhì)量濃度依次為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/mL 的溶液，加95%甲醇定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。取樣品（批號(hào)為20181213），搖勻，精密量取5 mL，置50 mL 容量瓶中，加95%甲醇約30 mL，超聲10 min 使溶解，取出，放冷，加95%甲醇定容至刻度，用0.45 μm 濾膜濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品貯備溶液適量，精密量取，制成含甘草苷、特女貞苷和甘草酸質(zhì)量濃度分別為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/mL 的對(duì)照品溶液，加95%甲醇定容至刻度，搖勻，分別注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，分別以甘草苷、特女貞苷和甘草酸質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回歸方程及線性范圍（ n=6）

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品貯備溶液適量，精密量取，加95%甲醇制成含甘草苷、特女貞苷和甘草酸質(zhì)量濃度為5.0 μg / mL 的混合對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6 次，按擬訂色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果甘草苷、特女貞苷和甘草酸峰面積的RSD分別為1.28%，0.68%，0.92%（n =6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20181213）樣品，搖勻，依法平行制備6 份供試品溶液，分別注入液相色譜儀，測(cè)定甘草苷、特女貞苷和甘草酸的峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果甘草苷、特女貞苷和甘草酸含量的RSD分別為3.24%，2.21%，3.32%（n =6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液任意1 份，室溫放置，分別于0，3，6，9，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定甘草苷、特女貞苷和甘草酸的峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果甘草苷、特女貞苷和甘草酸含量的RSD分別為1.82%，1.41%，1.34%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知甘草苷、特女貞苷和甘草酸含量的樣品（批號(hào)為1807012），搖勻，精密量取5 mL，共6 份，分別置50 mL 容量瓶中，加入適量2.2 項(xiàng)下對(duì)照品貯備溶液，依法制備供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 高效液相色譜圖

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

隨機(jī)選取樣品6 批次，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定峰面積，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中甘草苷、特女貞苷和甘草酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量檢測(cè)結(jié)果（mg）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

采用紫外-可見(jiàn)分光光度法，掃描范圍190 ～400nm，對(duì)甘草苷、特女貞苷和甘草酸3 種待測(cè)物單標(biāo)溶液（質(zhì)量濃度為20 μg/mL）進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果甘草苷、特女貞苷和甘草酸最大吸收波長(zhǎng)分別在236，230，237 nm 附近。故選擇229 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，3 種待測(cè)物響應(yīng)良好，定量結(jié)果準(zhǔn)確。

3.2 流動(dòng)相選擇

試驗(yàn)配制了甘草苷、特女貞苷和甘草酸的混合溶液（3 種待測(cè)物質(zhì)量濃度均為5 μg/mL），按擬訂色譜條件，分別采用0.1%磷酸溶液-乙腈、0.1%磷酸溶液-甲醇作為洗脫體系，考察3 種待測(cè)物的分離效果和分析時(shí)間。采用甲醇體系時(shí)，基線噪音大，且甘草酸洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)效果偏低；采用乙腈體系時(shí)，基線平穩(wěn)，甘草酸洗脫時(shí)間短，檢測(cè)效率高，且各物質(zhì)的分離效果良好。故選擇乙腈洗脫體系。

3.3 小結(jié)

本研究中建立了同時(shí)測(cè)定夜寧糖漿中甘草苷、特女貞苷和甘草酸3 種活性成分含量的反相高效液相色譜法，精密度高，重復(fù)性好，線性范圍廣，檢測(cè)準(zhǔn)確度高，可用于控制夜寧糖漿的質(zhì)量。