裴海燕，高慧珠，孫密樸，葉盛英，李 麗

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八三醫(yī)院藥劑科，天津300142）

小兒牛黃清心散是由天麻、膽南星、黃連、赤芍、大黃、朱砂、雄黃等14 味藥材組方的中成藥，具有清熱化痰、鎮(zhèn)靜止痙的作用，主要用于小兒內(nèi)熱引起的痰喘急驚、四肢抽搐、神志昏迷等癥狀[1-3]。方中，朱砂可清心鎮(zhèn)驚、安神解毒[4-5]，雄黃可解毒殺蟲、燥濕祛毒[6-7]，二者聯(lián)用與該藥的藥效作用一致。但朱砂的主要化學(xué)成分為硫化汞（HgS），此外還有少量的游離汞和可溶性汞鹽，如氯化汞、氧化汞等[8-9]。硫化汞化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，難溶于鹽酸和硝酸，在人體胃中難以吸收，基本均隨糞便排除，因此口服硫化汞對(duì)人體基本無毒。但朱砂中還有少量氯化汞和可溶性汞鹽，具有較大毒性，長期服用會(huì)損壞人體肝臟和腎臟，同時(shí)對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)有慢性毒性[10-11]。雄黃的主要成分是硫化砷（As2S2），在人體胃腸道難以吸收，幾乎無毒，但藥材中含有少量的可溶性砷鹽和三氧化二砷（As2O3），是劇毒物質(zhì)[12-13]。目前，朱砂和雄黃的傳統(tǒng)炮制方法均為水飛法，主要是為了減少可溶性的汞（Hg）和砷（As），降低毒性。小兒牛黃清心散現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中無對(duì)朱砂和雄黃藥材的質(zhì)量控制[1]，只有散劑通則的檢查項(xiàng)。本試驗(yàn)中對(duì)該制劑中可溶性Hg 和As 的含量測(cè)定進(jìn)行探討，目前對(duì)于Hg 和As 的測(cè)定主要有原子吸收光譜法[14-15]、原子熒光法[16]，電感耦合等離子體-質(zhì)譜（ICP-MS）[17 -18] 法及柱前衍生高效液相色譜法等[19]，參考中國藥典和上述文獻(xiàn)，建立ICP-MS 法同時(shí)測(cè)定小兒牛黃清心散中可溶性Hg 和As 的含量，可為控制該藥的安全性和有效性，以及對(duì)改進(jìn)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

儀器：PerkinElmer Nexlon300x 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國鉑金埃爾默公司）；ETHOS UP A 型微波消解儀（美國Milistone 公司）；SHA-B 型恒溫水浴振蕩器（常州金壇友聯(lián)儀器研究所）：Sartorius BP210S 型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

試藥：小兒牛黃清心散樣品（山東廣育堂國藥有限公司，規(guī)格為每袋0.3，批號(hào)分別為20181203，20190109，20190201）；汞單元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[批號(hào)為GBW（E）081593，質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL]，砷單元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（批號(hào)為GBW08611 -15105，質(zhì)量濃度為1 000 μg / mL），金溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（批號(hào)為GSB 04-1715-2006，質(zhì)量濃度為1 000 μg / mL）；內(nèi)標(biāo)溶液鍺（Ge），鉍（Bi）（質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL），所有單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液均購自國家計(jì)量科學(xué)研究院。KED 調(diào)諧液為儀器自帶，購自美國珀金埃爾默公司；65%硝酸為優(yōu)級(jí)純（美國Merk兩合公司）；鹽酸、胃蛋白酶（上海國藥化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水（電阻率≥18.3 MΩ·cm，美國Millipore 超純水機(jī)制備）；液氮為高純液氮。

人工胃液：取稀鹽酸16.4 mL，加水800 mL、胃蛋白酶10 g，搖勻，再加水稀釋成1 000 mL，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件

ICP-MS 工作參數(shù)：RF 射頻功率為1 300 W，等離子體氣體流量為18 L/min；霧化氣流速為0.82 L/min，輔助氣體流量為1.5 L/min，采樣深度為7.2 mm，樣品提升速率為1.0 L/min；液氬壓力為0.7 MPa；脈沖電壓為780 V；樣品沖洗30 s，延遲10 s；調(diào)諧模式為碰撞模式KED；數(shù)據(jù)采集重復(fù)測(cè)定3 次，測(cè)定時(shí)As 以Ge 作內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，Hg 以Bi 作內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行校正。

2.2 溶液制備

分別精密吸取As 和Hg 2 種單元素的對(duì)照品溶液適量，用超純水稀釋成每1 mL 中分別含As 1，5，10，20，40 ng 和含Hg 1，2，4，8，16 ng 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取內(nèi)標(biāo)元素Bi 和Ge 標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL）適量，用超純水稀釋成每1 mL 含Bi 和Ge 0.1 μg/mL 的對(duì)照品混合溶液。稱取樣品（批號(hào)為20181203）0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50 mL 人工胃液，于恒溫振蕩器中37 ℃振蕩4 h，振蕩頻率150 r/min，取出，置離心機(jī)上，以4 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取2.2 項(xiàng)下的As 和Hg 2 種元素的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣管插入0.1 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液中，同時(shí)按從低到高的質(zhì)量濃度依次將進(jìn)樣管插入上述2 種元素的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中，以3 次讀數(shù)的平均值為縱坐標(biāo)（Y）、相對(duì)應(yīng)的進(jìn)樣質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸。得線性回歸方程分別為Y202Hg=0.0071X+0.004 0，r=0.999 2（n=3）；Y75As=0.012 2X+0.008 1，r=0.999 1（n =3）。結(jié)果表明，As 和Hg 進(jìn)樣質(zhì)量濃度分別在0 ～16 ng/mL 和0 ～40 ng/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下的As 和Hg 2 種元素混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別取其低、中、高3 種不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按2.1 項(xiàng)下條件測(cè)定，每種質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定6 次，記錄測(cè)量值。結(jié)果Hg 元素的RSD分別為4.02%，2.43%，1.13%，As 元素的RSD分別為3.40%，2.42%，1.21% （n=6），RSD均在5%內(nèi)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20181203）0.2 g，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，按2.1 項(xiàng)下條件測(cè)定，每份樣品重復(fù)測(cè)定3 次，分別計(jì)算Hg 和As 的含量。結(jié)果Hg 和As 的平均含量分別為0.068 6 mg/kg 和0.989 9 mg/kg，RSD分別為3.43%和3.22%（n=3），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20181203）0.2 g，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下條件分別于0，1，2，4，8，16，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄測(cè)定值。結(jié)果Hg 和As 2 個(gè)元素的RSD分別為4.04%和2.31%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20181203）0.1 g，精密稱定，共稱取6 份，置具塞三角錐形瓶中，精密吸取上述Hg 和As 標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，用水稀釋成每1 mL 含Hg 10 ng、As 100 ng 的混合溶液，分別加入上述6 份樣品中，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取各批樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下條件測(cè)定，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計(jì)算3 批樣品中可溶性Hg 和As 的含量。結(jié)果見表2。

表2 各批樣品中可溶性Hg 和As 的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品制備方法

試驗(yàn)前期，對(duì)供試品的取樣量采用正交試驗(yàn)L9（33）進(jìn)行了考察。當(dāng)取樣量過大時(shí)，測(cè)定時(shí)需要多步驟地稀釋，容易導(dǎo)致誤差偏大；樣品量過少，當(dāng)采用人工胃液提取時(shí)，可溶性的Hg 含量太低，測(cè)量誤差大，不易獲得準(zhǔn)確值。綜合考慮，取樣量為0.2 g 合適。對(duì)供試品的提取時(shí)間進(jìn)行了考察，分別在2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間的延長，樣品中可溶性Hg 和As 的含量增大，但當(dāng)提取時(shí)間超過4 h 時(shí)，可溶性Hg和As 的含量變化不大。綜合考慮人體實(shí)際服用藥物時(shí)間，選擇供試品的提取時(shí)間為4 h。Hg 具有較強(qiáng)的吸附性，極易附著在儀器的采樣錐和矩管上，影響As 的測(cè)定，因此在樣品中需要加入一定的金元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，由于Hg 可與金形成金汞齊，使其溶解，可減少儀器污染，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 可溶性Hg 和As 測(cè)定

方中朱砂和雄黃2 種藥材均含有游離Hg、游離As和可溶性的汞鹽和砷鹽，毒性較大，不同炮制方法對(duì)朱砂和雄黃中可溶性Hg 和As 的含量差異很大，當(dāng)采用傳統(tǒng)的水飛法進(jìn)行炮制時(shí)，可溶性Hg 和As 含量最低；同時(shí)，也可除去藥材中其他部分重金屬及其鹽類，大大降低了藥材的毒性。目前，朱砂和雄黃的炮制主要采用機(jī)械化（球磨機(jī)）干法研磨，不僅會(huì)使Hg 和As 游離出來，同時(shí)也不能除去可溶性Hg 和As，以及其他類重金屬，從而導(dǎo)致朱砂和雄黃中毒?？讖V英等[12]通過砷鹽古蔡氏法測(cè)得小兒牛黃清心散中可溶性As 含量為0.1% ～0.2%，與本研究結(jié)果基本一致。

3.3 ICP-MS 法的優(yōu)點(diǎn)

ICP-MS 法同時(shí)測(cè)定多種元素時(shí)具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，且具有一次進(jìn)樣同時(shí)測(cè)定多個(gè)元素的優(yōu)勢(shì)，縮短試驗(yàn)時(shí)間，儀器的靈敏度最高，減少相互之間的干擾，補(bǔ)償基體效應(yīng)。依據(jù)質(zhì)量數(shù)相近、電離電位相近的原則選209Bi 作為202Hg、72Ge 作為75As 的內(nèi)標(biāo)溶液，從而減少元素的直接干擾。同時(shí)，為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性、試驗(yàn)所用容量瓶和大肚吸管均為聚乙烯塑料材質(zhì)，并采用20%硝酸浸泡過夜洗凈后使用，所有量瓶和大肚吸管均經(jīng)計(jì)量院校準(zhǔn)合格后使用。