胡厚軍，鄭 學(xué)，李 陽

（廣東省深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳 518020）

腎缺血再灌注損傷（RIRI）是急性腎損傷的重要誘因，發(fā)生機(jī)制涉及氧自由基增多、炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、能量代謝障礙及某些激素代謝失調(diào)等[1]。研究證實(shí)，缺血預(yù)處理能減輕RIRI，而發(fā)生再灌注的最初幾分鐘是決定腎臟缺血最終預(yù)后的關(guān)鍵時(shí)間段，與缺血預(yù)處理相比，對(duì)再灌注前進(jìn)行干預(yù)的缺血后處理，因其可操作性更強(qiáng)，具有更好的應(yīng)用前景[1]?？嗟幼⑸湟菏怯删湛浦参锉o苦荬菜全草中提取的有效活性物質(zhì)制成的靜脈用注射液，主要成分為腺嘌呤核苷、黃酮等，具有活血化瘀、抗血小板聚集、增強(qiáng)纖維蛋白酶活性、增強(qiáng)超氧化物歧化酶（SOD）活性和保護(hù)人腦微血管細(xì)胞的作用，可用于缺血性卒中、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ê?jiǎn)稱冠心?。?、心絞痛的治療[2-4]。研究表明，大鼠腎缺血再灌注模型術(shù)前預(yù)先腹腔注射苦碟子后能減輕RIRI，其機(jī)制與其抗氧化應(yīng)激、減輕炎性損傷有關(guān)[5]，但術(shù)后再灌注前使用苦碟子是否也可通過抗氧化機(jī)制保護(hù)腎臟尚不清楚。本研究中建立大鼠RIRI 模型，旨在觀察苦碟子對(duì)大鼠RIRI 的預(yù)防作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，為臨床防治RIRI 提供可行性措施?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器與試藥

動(dòng)物：健康雄性SD 大鼠30 只，普通級(jí)，10 周齡，體質(zhì)量220 ～250 g，購自西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SYXK（川）2018-213，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)0000422，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)0001797。標(biāo)準(zhǔn)飼料和水飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

儀器：無創(chuàng)動(dòng)脈夾（北京搏貝科技有限公司）；CX31型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；AU5800 型生化分析儀（美國Beckman 公司）；TG16 型離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；MK3 型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher 公司）。

試藥：苦碟子注射液（通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字Z20025450，規(guī)格為每支10 mL）；SOD 試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有公司）；白細(xì)胞介素6（IL-6）定量分析酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（ELISA）試劑盒、電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（北京博凌科為生物科技有限公司）；兔抗大鼠核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）單克隆抗體（0.1 mL），山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG） -辣根過氧化物酶抗體（0.1 mL），（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；β-Actin（0.1 mL，美國Santa Cruz 公司）；3%戊巴比妥鈉（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模與給藥

將30 只SD 大鼠分為假手術(shù)組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（等體積0.9%氯化鈉溶液）和苦碟子組（4 mL/kg），各10 只。術(shù)前12 h 禁食，取仰臥位固定，常規(guī)備皮、消毒，腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉以麻醉大鼠，開腹，沿腹部正中切口，暴露雙側(cè)腎動(dòng)靜脈并小心分離，以無創(chuàng)動(dòng)脈夾同時(shí)夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈45 min 后放開動(dòng)脈夾恢復(fù)血流灌注，腎臟顏色由醬紫色變?yōu)榘导t色表明RIRI 模型建立成功。假手術(shù)組大鼠開腹后分離雙側(cè)腎動(dòng)脈，不進(jìn)行夾閉，暴露45 min 后逐層縫合，關(guān)腹。恢復(fù)血流灌注前5 min 同一時(shí)刻，各組大鼠經(jīng)尾靜脈注射給予相應(yīng)藥物。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè)

病理組織學(xué)檢查：于缺血再灌注24 h 后處死大鼠，以0.9%氯化鈉溶液灌注腎臟后摘取，將摘取部分腎臟置10%甲醛中固定后行石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察染色后腎臟病理組織學(xué)變化[6]。

腎功能指標(biāo)檢測(cè)：于大鼠腹主動(dòng)脈采血3 mL，置離心管中，3 000 r/min 離心20 min，取上清液，以生化分析儀檢測(cè)大鼠血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）水平[7]。

圖1 大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化（HE，×400）

腎勻漿中IL-6 含量檢測(cè)：采用ELISA 法檢測(cè)。將摘取部分腎臟剪切成小塊，磨碎后加入磷酸鹽緩沖液（PBS）常規(guī)離心，棄上清液，加入Buffer A 和Buffer B 進(jìn)行振蕩，在4 ℃條件下，15 000 r/min 離心10 min，取上清液得細(xì)胞質(zhì)蛋白，將Buffer C 加入沉淀物中，振蕩，離心，取上清液得核蛋白。在反應(yīng)板孔中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體，封板膜蓋住反應(yīng)板37 ℃水浴60 min，揭開封板膜棄去液體，加洗滌液靜置20 s，甩液拍干（重復(fù)4 次）；將底物液A 和B 按1 ∶1 體積混合后加入孔中；封板，在37 ℃條件下水浴15 min，在孔中加入終止液，以酶標(biāo)儀檢測(cè)并記錄數(shù)據(jù)[8]。

腎勻漿SOD 活性和MDA 含量檢測(cè)：將摘取的部分大鼠腎臟以研磨棒磨碎后稱定質(zhì)量，制成腎組織勻漿，取10%組織勻漿50 μL，在4 ℃條件下，15 000 r/min離心10 min，取上清液，檢測(cè)SOD 活性和MDA 含量[9]。

NF-κB 蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用Western Blot 法檢測(cè)。將上述部分腎組織勻漿轉(zhuǎn)入離心管，加苯甲基磺酰氟冰浴裂解30 min，在4 ℃條件下，10 000 r/min 離心15 min，取上清液，以蛋白定量（BCA）法檢測(cè)蛋白含量。各組取100 μg 上樣，10%十二烷基硫酸鈉（SDS） -聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）后濕法電轉(zhuǎn)，10%SDS-PAGE 電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，將5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，依次加入兔抗大鼠NF-κB 單克隆抗體及山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶抗體，室溫下孵育30 min，TBST 洗膜3 次，加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，將PVDF膜放入暗盒中，壓上X 膠片，取出膠片后顯影、定影、清洗。然后，通過Image J 軟件將條帶灰度值數(shù)字化，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值為各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量[10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎組織形態(tài)學(xué)變化

假手術(shù)組大鼠腎小球及腎小管清晰可見；模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞明顯受累，腎小管管腔擴(kuò)張，部分細(xì)胞核破裂，管型形成，腎小球有炎性細(xì)胞浸潤；苦碟子組大鼠腎小管損傷程度明顯輕于模型組，細(xì)胞核基本正常，腎小管內(nèi)僅見少量管型。詳見圖1。

2.2 血清SCr 和BUN 水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清SCr 和BUN 水平均顯著升高（P ＜0.05）；與模型組比較，苦碟子組大鼠血清SCr 和BUN 水平均顯著降低（P ＜0.05）。詳見表1。

表1 3 組大鼠血清SCr 和BUN 水平比較（± s，n=10）

表1 3 組大鼠血清SCr 和BUN 水平比較（± s，n=10）

組別假手術(shù)組模型組苦碟子組F 值P 值劑量（mL/kg）4 4 4 SCr（μmol/L）43.41 ±3.25 197.56 ±11.43 89.28 ±5.47 1 098.323 0.001 BUN（mmol/L）6.84±0.58 23.83±2.36 11.27±1.49 286.754 0.000

2.3 腎勻漿IL-6，SOD，MDA 水平及NF-κB 蛋白表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎勻漿IL-6 和MDA 水平及NF-κB 蛋白表達(dá)水平均顯著升高，SOD水平顯著降低（P ＜0.05）；與模型組比較，苦碟子組大鼠腎勻漿IL-6 和MDA 水平及NF-κB 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，SOD 水平顯著升高（P ＜0.05）。詳見表2。

表2 3 組大鼠腎勻漿IL-6，SOD，MDA 水平及NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較（± s，n=10）

表2 3 組大鼠腎勻漿IL-6，SOD，MDA 水平及NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較（± s，n=10）

組別假手術(shù)組模型組苦碟子組F 值P 值劑量（mL/kg）4 4 4 SOD/（U/mg）76.54±4.21 35.46±3.68 58.72±3.14 130.360 0.000 MDA/（nmol/mg）5.15±0.97 9.23±1.35 7.11±1.06 6.411 0.013 IL-6（ng/mL）105.27±21.18 1 482.21±84.32 655.36±57.44 431.620 0.000 NF-κB 蛋白0.11±0.02 0.82±0.04 0.34±0.02 1 327.268 0.001

3 討論

腎臟在重獲血流灌注后會(huì)釋放過量的炎性介質(zhì)，產(chǎn)生大量氧自由基，從而造成RIRI[5]。多種疾病可引起RIRI，同種異體腎移植更不可避免地會(huì)引起RIRI[11-12]。因此，RIRI 的早期預(yù)防具有重要臨床價(jià)值。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苦碟子能通過抗氧化應(yīng)激和抑制黏附分子表達(dá)等機(jī)制防護(hù)膿毒血癥所致急性腎損傷[13]。

本研究中，鏡下觀察模型組大鼠腎小管明顯腫脹，管腔擴(kuò)張伴管型形成，腎小球有炎性細(xì)胞浸潤，提示模型建立成功。腎臟在缺血再灌注后炎性反應(yīng)較重，有一定程度的損傷，在再灌注前尾靜脈注射苦碟子，腎小管損傷程度明顯減輕。同時(shí)，苦碟子組血清SCr 和BUN 水平明顯低于模型組，也提示苦碟子可改善RIRI 模型大鼠的腎臟功能。

SOD 是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，反映機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA 是脂質(zhì)過氧化重要產(chǎn)物，可通過組織中MDA 含量評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化的程度，以間接測(cè)定氧自由基對(duì)組織細(xì)胞的損傷程度。腎臟發(fā)生缺血再灌注時(shí)，腎勻漿SOD 水平降低，MDA 水平升高。與模型組比較，苦碟子組大鼠的腎勻漿SOD 水平升高，而MDA 水平降低。提示大鼠腎缺血再灌注前使用苦碟子可增強(qiáng)腎組織的抗氧化能力，從而緩解氧化損傷，與楊潔等[5]的研究結(jié)果一致。氧自由基是RIRI 的重要介質(zhì)，能攻擊生物膜導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷，引起細(xì)胞的腫脹變形，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制失靈，而苦碟子注射液中的活性成分經(jīng)分析篩選發(fā)現(xiàn)能捕獲超氧陰離子和羥自由基，達(dá)到抗氧化應(yīng)激、抑制炎性因子表達(dá)的作用，從而降低血清MDA 水平，升高血清SOD 水平，緩解RIRI 的發(fā)生[14]。

NF-κB 是轉(zhuǎn)錄過程中RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄時(shí)所需要的一種輔助因子，炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激相互影響并參與細(xì)胞損傷過程，其共同的樞紐可能是NF-κB，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變會(huì)引起多種炎性疾病發(fā)生。研究顯示，NF-κB 信號(hào)通路參與RIRI 并通過對(duì)促炎等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控影響IL-6 的表達(dá)，而IL-6 表達(dá)上調(diào)會(huì)加重腎臟的炎性反應(yīng)[4，15]。故IL-6 和NF-κB 的表達(dá)量可評(píng)價(jià)RIRI 的程度。有報(bào)道顯示，苦碟子可能通過下調(diào)腦缺血模型大鼠的Toll 樣受體4（TLR-4），通過NFκB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，改善大腦缺血性損傷，且苦碟子可能在大鼠腦缺血過程中調(diào)節(jié)抗氧化能力，從而減輕其心肌損傷[16-17]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠IL-6 和NF-κB 蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯升高，苦碟子組較模型組明顯降低，提示大鼠腎臟缺血后再灌注前使用苦碟子能明顯抑制其再灌注損傷過程中IL-6 和NFκB 的表達(dá)，從而緩解腎臟炎性損傷。研究發(fā)現(xiàn)，從苦碟子中分離得到的部分倍半萜內(nèi)酯類成分可抑制核因子κB 抑制蛋白（IκB）的磷酸化及降解，從而抑制NF-κB p65 的核轉(zhuǎn)移，苦碟子可能是通過其含有的倍半萜內(nèi)酯類成分抑制NF-κB 活性而影響IL-6 的表達(dá)，以緩解RIRI 的發(fā)展[12]。

綜上所述，大鼠腎缺血后再灌注前使用苦碟子能緩解大鼠RIRI，其機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激并下調(diào)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而緩解炎性損傷有關(guān)。