李萬(wàn)芳，余登升，劉敬民

（1. 山東英才學(xué)院學(xué)前教育學(xué)院，山東 濟(jì)南 250104； 2. 山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250033）

目前已知，很多疾病的發(fā)生與自由基反應(yīng)有關(guān)，失控和異常的自由基反應(yīng)可由生理?xiàng)l件下產(chǎn)生的自由基引發(fā)，也可由外源性化學(xué)試劑或由物理性的電離輻射所致的自由基引起[1-2]。由于生物體內(nèi)不存在清除過(guò)量自由基的酶系或抗氧化劑，故適當(dāng)補(bǔ)充外源性自由基清除劑或給予能促使機(jī)體內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)恢復(fù)到一定水平的藥物，可使各種損傷得以改善。由于擔(dān)心合成抗氧化劑會(huì)給機(jī)體帶來(lái)不良反應(yīng)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者越來(lái)越關(guān)注從中草藥資源中提取天然抗氧化劑[3-6]?，F(xiàn)代藥物化學(xué)研究表明，北蟲草含有腺苷、蟲草素、蟲草酸、蛋白質(zhì)、多糖、超氧化物歧化酶等活性成分[7-10]，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[11-14]。本研究中探討了山東栽培北蟲草的抗氧化活性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：FZ102 型微型植物粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；RE-52 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；UV-9100B 型紫外-可見分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司）；FA-1104 型電子天平（上海天平儀器廠）；KQ-2200 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

試劑：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH 自由基，梯希愛公司）；鄰苯三酚（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸；三羥甲基氨基甲烷（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）；石油醚（60 ～90℃，天津廣成化學(xué)試劑有限公司）；乙酸乙酯（分析純，天津天大化工實(shí)驗(yàn)廠）；正丁醇（天津廣成化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水；其他試劑均為分析純。

藥物：本研究所用北蟲草Cordyceps militaris樣品為臨沂費(fèi)縣栽培北蟲草，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院石俊英教授鑒定為正品，低溫烘干，粉碎，過(guò)60 目篩，密封備用。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

取北蟲草粉末200 g，置燒瓶中，加入6 倍量的石油醚（60 ～90 ℃）浸泡過(guò)夜，超聲提取2 次，每次1 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓（60 ℃，0.1 MPa），回收溶劑，真空干燥（60 ℃，0.1 MPa），得黃色黏稠油狀物石油醚提取部位，備用；濾渣揮干溶劑，依次用乙酸乙酯、正丁醇、蒸餾水等溶劑替換石油醚，重復(fù)上述工藝步驟，制備北蟲草不同極性部位，其中乙酸乙酯部位為棕黃色黏稠狀，正丁醇和水提取部位均為棕褐色。

北蟲草成人推薦用量為3.0 g/d，根據(jù)前期試驗(yàn)，各部位提取率折合成原藥材計(jì)算，分別精確稱取北蟲草石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位、水提取部位、維生素C 適量（對(duì)照組），配制質(zhì)量濃度分別為3.000，1.500，0.750，0.375，0.187 5 g/L 的樣品溶液。

1.2.2 超氧陰離子清除能力測(cè)定

試液配制：精密稱取三羥甲基氨基甲烷（Tris）0.6057g與乙二胺四乙酸二鈉（EDTA·2Na）37.2 mg，溶于62.4 mL 0.1 mol/L 鹽酸溶液中，用蒸餾水定容至100 mL，得0.05 mol/L 三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷（Tris）-HCl 緩 沖 液（pH=8.20）。精密稱取鄰苯三酚0.63 g，用10 mmol/L的鹽酸溶液溶解，并定容至100 mL，避光保存，得50 mmol/L 鄰苯三酚溶液。

抗氧化活性：利用數(shù)顯恒溫水浴鍋控制溫度在25 ℃，將Tris-HCl 緩沖液和鄰苯三酚溶液混勻，再加入北蟲草不同濃度不同極性提取部位，迅速搖勻，以10 mmol/L HCl 溶液作為參比，于325 nm 波長(zhǎng)處，每隔30 s 測(cè)定吸光度（A）值。通過(guò)比較抑制鄰苯三酚自氧化速率的程度，分析北蟲草不同極性部位抗氧化活性強(qiáng)弱。結(jié)果以清除率（S）表示，S（%）=（1- ΔA/ ΔA0）×100%。其中，ΔA0為鄰苯三酚自氧化速率，ΔA為加入樣品后鄰苯三酚自氧化速率。

1.2.3 DPPH 自由基清除能力測(cè)定

DPPH 溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取DPPH 0.021 6 g，加無(wú)水乙醇溶解，定容，置50 mL 棕色容量瓶中，作為貯備液。精密移取上述貯備液10 mL，置100 mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度為43.2 mg/L 的貯備液，備用。分別精密移取DPPH 貯備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 mL 置7 個(gè)10 mL 棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度。以無(wú)水乙醇溶劑為空白對(duì)照，用UV-9100B 紫外-可見分光光度計(jì)在517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各溶液的吸光度。以DPPH 的質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)（X）、吸光度（A）為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。得回歸方程Y=0.023 8X-0.003 6，R2=0.999 5（n=6）。結(jié)果表明，DPPH 質(zhì)量濃度在4.32 ～30.24 mg/L 內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，可用于DPPH自由基清除率的測(cè)定。

DPPH 自由基清除能力測(cè)定：精密移取無(wú)水乙醇、DPPH 溶液各2 mL，置10 mL 具塞試管中，混合后充分振搖，室溫下暗處?kù)o置30 min，于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（Ac）；精密移取供試品溶液、無(wú)水乙醇各2 mL，置10 mL 具塞試管中，混合后充分振搖，室溫下暗處?kù)o置30 min，于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（Aj）；精密移取供試品溶液、DPPH 溶液各2 mL，置10 mL 具塞試管中，混合后充分振搖，室溫下暗處?kù)o置30 min，于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（Ai）。

樣品對(duì)DPPH 自由基的清除率計(jì)算公式：DPPH 自由基清除率（%）= [1-（Ai-Aj）/Ac] ×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超氧陰離子清除能力

每組試驗(yàn)平行6 次，結(jié)果見表1?？梢?，北蟲草不同極性部位在不同質(zhì)量濃度均有一定的清除超氧陰離子能力。超氧陰離子清除率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，質(zhì)量濃度增大，清除率也升高。水提取部位、乙酸乙酯部位清除超氧陰離子的作用與維生素C 相比，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。北蟲草不同極性部位清除超氧陰離子能力的大小為水提取部位＞乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位。

表1 北蟲草不同極性部位的超氧陰離子清除能力（%）

2.2 DPPH 自由基清除能力

生物體新陳代謝過(guò)程中會(huì)生成活性氧自由基（ROS），ROS 過(guò)量導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷?？寡趸瘎┰陬A(yù)防活性氧引起的疾病中發(fā)揮著重要作用[15-16]。DPPH 自由基的清除率可用來(lái)評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。每組試驗(yàn)平行6 次，結(jié)果見表2?？梢?，北蟲草不同極性部位在不同濃度均有一定的清除DPPH 自由基能力。DPPH 自由基清除率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，質(zhì)量濃度增大，清除率也升高。水提取部位、乙酸乙酯部位清除DPPH 自由基的作用與維生素C 相比，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。北蟲草不同極性部位清除DPPH 自由基能力的大小為水提取部位＞乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位。

表2 北蟲草不同極性部位的DPPH 自由基清除能力（%）

3 討論

生物體內(nèi)自由基多種多樣，機(jī)體進(jìn)化產(chǎn)生多種抗氧化系統(tǒng)，各物質(zhì)的抗氧化機(jī)制也不盡相同，樣品對(duì)一種自由基的清除能力不能完全代表對(duì)另一種自由基的清除能力，因此，以單一方法評(píng)定抗氧化物的抗氧化能力不合理。測(cè)定物質(zhì)的抗氧化性能時(shí)往往采用2 種或更多不同的抗氧化測(cè)定方法，來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化能力[17]。目前測(cè)定抗氧化能力的方法較多，但并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法，本研究結(jié)果顯示，北蟲草水提取部位、乙酸乙酯部位清除超氧陰離子和DPPH 自由基的能力與維生素C相近，表明北蟲草是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑來(lái)源，值得開發(fā)利用。

藥食兩用真菌是產(chǎn)生天然活性化合物的寶庫(kù)。天然抗氧化劑作為一類重要的生物活性物質(zhì)，可清除人體新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，延緩機(jī)體衰老。本研究結(jié)果顯示，北蟲草4 個(gè)部位對(duì)超氧陰離子和DPPH 自由基均具有一定的清除能力。當(dāng)北蟲草水提取部位質(zhì)量濃度為3 g/L 時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除率達(dá)到81.32%，甚至超過(guò)了同質(zhì)量濃度的維生素C；當(dāng)北蟲草乙酸乙酯部位、水提取部位質(zhì)量濃度為3 g/L 時(shí)，對(duì)DPPH 自由基的清除能力分別為85.06%和91.65%，表明上述部位具有良好的清除效果?？梢姡毕x草具有良好的體外抗氧化功效。綜合各抗氧化試驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)山東栽培北蟲草清除自由基活性成分主要存在于水提取部位和乙酸乙酯提取部位，其活性成分主要有蟲草多糖、蟲草素、腺苷、超氧化物歧化酶、麥角甾醇等，但北蟲草各活性物質(zhì)的抗氧化活性還有待于進(jìn)一步分離純化后確定。