胡獻躍，戴關海，王晨霞

（1. 金華職業(yè)技術學院，浙江 金華 321017； 2. 浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江 杭州 310007）

晚期及轉移性乳腺癌常與表皮生長因子受體（EGFR）族[包括EGFR，人表皮生長因子受體2（HER2），HER3，HER4]酪氨酸激酶的過度表達和激活有關。若乳腺癌患者HER2 過度表達時，疾病進展和死亡風險則顯著升高[1-2]。甲苯磺酸拉帕替尼是EGFR 和HER2 雙重抑制劑[3]，用于晚期或轉移性乳腺癌的治療[4-6]。但由于其在水中不溶，生物利用度只有10% ～20%[7]。固體分散技術將藥物以分子、微晶、無定形態(tài)分散在適宜載體中，可提高藥物（尤其是難溶性藥物）的表觀溶解度和溶出速率，從而提高藥效[8]。本研究中以Soluplus? 為載體、ploxama188為增塑劑，通過藥載比的調節(jié)，制備不同表觀溶解度的固體分散體，并利用裸鼠乳腺癌模型、HER2 和EGFR蛋白表達水平測定，評價甲苯磺酸拉帕替尼固體分散體對移植瘤的抑制效果?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器：Centrifuge 5810R 型離心機（Eppendorf，德國艾本德股份公司）；3111 型CO2水套培養(yǎng)箱（美國熱電公司）；無菌超凈臺HR40-Ⅱ-A2 型（青島海爾特種電器有限公司）；Agilent 高效液相色譜儀（包括1260 四元泵，1260DAD 檢測器，1260 自動進樣器，美國安捷倫科技公司）；NIS-Elements D 3.2 型圖像分析儀（日本尼康株式會社）；卡尺及其他材料。

瘤株：人乳腺癌細胞株MDA-MB-231，由浙江省中醫(yī)藥研究院腫瘤所提供，液氮保存。

動物：BALB/c-nu 雌性裸小鼠，SPF 級，體質量19 ～22 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號為SCXK（京）2016-0006，動物合格證號為11400700303981，飼養(yǎng)條件為室溫25 ℃，相對濕度70%，自由進食與飲水。實驗動物使用許可證為SYXK（浙2014-0003）。

藥物與試劑：甲苯磺酸拉帕替尼固體分散體[自制，批號為180502（1 ∶0.5 ∶0.5），180509（1 ∶1 ∶1），180512（1 ∶2 ∶1）]；TYKERB? 片（GSK，批號為17045073，規(guī)格為每片250 mg）；EGFR 一抗（批號為18986-1-AP）；HER2 一抗（批號為18299-1-AP），均由Proteintech公司提供；DMEM 高糖培養(yǎng)基（1X，批號為1801030303），RPMI.1640 培養(yǎng)液（1X，批號為1711140506），PBS 緩沖液（1X，批號為1804110105），均由吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 固體分散體制備

以Soluplus? 為載體、ploxama188 為增塑劑，采用溶劑揮發(fā)法制備固體分散體[9]，分別制備高水溶性固體分散體[Lapatinib ditosylat-Soluplus? -泊洛沙姆188（1 ∶2 ∶1）]，中水溶性固體分散體[Lapatinib ditosylat-Soluplus? -泊洛沙姆188（1 ∶1 ∶1）]和低水溶性固體分散體[Lapatinib ditosylat-Soluplus? -泊洛沙姆188（1 ∶0.5 ∶0.5）]。

1.2.2 表觀溶解度測定

色譜條件：色譜柱為Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙酸銨溶液（pH 調至4）-乙腈（1 ∶1）；流速為1.0 mL/min；柱溫為40 ℃；測定波長為260 nm。

測定方法：取甲苯磺酸拉帕替尼原料、TYKERB?片和固體分散體適量（約含拉帕替尼10 mg），置25 mL容量瓶中，加水適量，超聲溶解20 min，加水定容，溶液在攪拌下置（25±1.0）℃平衡2 h，經0.45 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液，采用高效液相色譜法測定。

1.2.3 動物模型構建及分組

取雌性BALB/c-nu 裸鼠2 只，右腋皮下接種MDA-MB-231 細胞懸液（5×107/mL），每只0.2 mL，常規(guī)飼養(yǎng)50 d 后，脫頸處死，剝離皮下腫塊，剪成2 ～3 mm的碎塊，種植于50 只裸鼠乳腺脂肪墊下，縫合切口，術后繼續(xù)無菌飼養(yǎng)。當腫瘤長到100 mm3左右時，開始分組、稱重、給藥[10]。按隨機法分為5 組[高水溶性組（A1組）、中 水 溶 性 組（A2組）、低 水 溶 性 組（A3組）、TYKERB? 對照組（B 組）和模型組（C 組）]，每組10 只。給藥組實驗時取各藥載比固體分散體和TYKERB? 粉末適量，加水配制為含拉帕替尼6.44 g/L 的混懸液，超聲處理20 min，給小鼠灌胃體積為25 mL/kg，相當于灌胃拉帕替尼161.0 mg/kg；C 組灌水25 mL/kg。各組動物每日灌胃1 次，共6 周。

1.2.4 移植瘤體積測定和抑制效果檢查

小鼠每周稱重，并測量腫瘤最大長徑（a）和橫徑（b），腫瘤體積（mm3）=（腫瘤長徑×腫瘤短徑2）/2。分別計算相對腫瘤體積和相對腫瘤增殖率（T/C，%），同時觀察腋窩是否能觸及腫大淋巴結，皮膚有無潰爛，裸鼠的活動狀態(tài)及生長情況有無異常。實驗結束時剝離實體瘤稱重，計算抑瘤率[11]。

抑瘤率（%）= [（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重] ×100%

取原位腫瘤和腫大淋巴結進行HE 染色病理檢查。

1.2.5 移植瘤中EGFR 和HER2 蛋白表達

采用免疫組化法測定各組移植瘤中EGFR 和HER2 蛋白表達量，腫瘤組織用10%中性福爾馬林固定24 h 后，石蠟包埋、切片、脫蠟及復水、微波抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、5%BSA 封閉、EGFR 和HER2 一抗孵育、二抗孵育、滴加SABC，DAB 顯色、復染細胞核及脫水封片。結果采用NIS-Elements D 3.2 型圖像分析儀分析，每張切片隨機取5 個視野，陽性細胞為黃褐色顆粒著色，用平均光密度值表示EGFR 和HER2 的蛋白表達量[12]。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件處理。計量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析，并行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 建模成功

實驗中各組裸鼠的活動狀態(tài)及生長情況無明顯異常，部分裸鼠腋窩淋巴結出現(xiàn)腫大，未見皮膚潰爛現(xiàn)象。裸鼠剝離實體瘤鏡下觀察結果見圖1。實體瘤質地較軟，部分腫瘤中心有乳酪狀壞死，乳腺結構受到破壞；腫瘤實體細胞豐富，缺少腺管狀結構；腫瘤細胞排列不規(guī)則，增生活躍，可見細胞核分裂現(xiàn)象；癌巢周圍可見淋巴細胞、漿細胞等細胞浸潤?？梢?，病理符合乳腺癌組織病理特征，裸鼠造模可靠。

圖1 MDA-MB-231 裸鼠移植瘤病理學檢查結果（HE 染色，×400）

2.2 表觀溶解度

測定結果表明，TYKERB? 與原料表觀溶解度基本一致。固體分散體中載體Soluplus? 和增塑劑ploxama188 均為非離子型表面活性劑，具有膠束增溶作用，同時2 種高分子材料對藥物的過飽和溶液具有很強的抑晶作用，維持拉帕替尼較高的過飽濃度，制備的固體分散體表觀溶解度為TYKERB? 的6.2 ～16.3 倍。

表1 各組小鼠移植瘤生長體積變化比較（± s，mm3，n=10）

表1 各組小鼠移植瘤生長體積變化比較（± s，mm3，n=10）

注：與C 組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01；與B 照組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。表3 和表4 同。

組別A1 組A2 組A3 組B 組C 組W0 103.8±13.45 98.1±15.23 102.4±14.16 95.8±18.10 97.0±13.62 W1 114.8±21.82 112.6±24.31 120.6±29.52 116.6±28.66 132.9±26.49 W2 124.5±29.04#123.7±30.79#134.8±31.25*134.1±20.57#180.3±40.96 W3 140.9±34.69#145.1±38.11#164.7±35.27*169.8±33.79*242.2±94.63 W4 157.7±55.23#△163.4±41.55#△190.8±38.56#202.7±37.65*288.4±99.00 W5 179.2±59.82#△183.9±48.36#△220.9±51.24*239.1±43.57 349.4±173.61 W6 197.7±62.38#▲201.5±58.66#▲240.6±52.08*267.7±42.16*420.6±218.32

2.3 移植瘤體積變化

各組移植瘤體積變化見表1。第1 周，各組腫瘤體積增長無明顯差異。給藥2 周后，C 組小鼠腫瘤體積快速增長；與C 組比較，A1組和A2組抑瘤作用顯著（P ＜0.01），A3組與B 組移植瘤增長也較C 組緩慢（P ＜0.05）。與B 組比較，A1組和A2組在第4 周后也顯示更強的抑瘤作用（P ＜0.01）。

2.4 抑瘤效果

各組相對腫瘤增殖率結果見表2。可見，隨著甲苯磺酸拉帕替尼表觀溶解度的增加，對移植瘤的抑制效果更顯著。各組抑瘤率結果見表3?？梢姡鞴腆w分散體組較C 組比較均有顯著差異（P ＜0.01），其中A1組和A2組與B 組比較，差異顯著（P ＜0.05）。

表2 各組相對腫瘤增殖率（%）

表3 拉帕替尼對MDA-MB-231 裸鼠移植瘤生長的影響（± s，n=10）

表3 拉帕替尼對MDA-MB-231 裸鼠移植瘤生長的影響（± s，n=10）

組別數(shù)量（只） 體質量（g）瘤重（g）A1 組A2 組A3 組B 組C 組開始10 10 10 10 10結束10 10 10 10 10開始19.2±0.94 19.3±0.81 19.2±0.73 19.3±0.65 19.3±0.72結束18.8±2.05 18.8±1.15 18.9±1.12 18.8±1.09 19.6±0.82 0.332±0.110#△0.334±0.090#△0.357±0.088#0.442±0.093*0.659±0.233抑瘤率（%）49.6 49.3 45.8 32.9

2.5 EGFR 和HER2 蛋白表達

由圖2 和圖3 可知，各實驗組和B 組對EGFR 和HER2 蛋白在腫瘤組織中表達的程度與C 組比較均明顯減弱（P ＜0.05）。A1組和A2組對目標蛋白的抑制作用明顯優(yōu)于B 組（P ＜0.05）。詳見表4。

圖2 MDA-MB-231 裸鼠移植瘤中EGFR 表達量（×40）

3 討論

甲苯磺酸拉帕替尼屬BCS Ⅳ類藥物，不溶于水，臨床需要大劑量給藥（1 250 mg/d）才能達到治療效果。增加難溶性藥物溶解度和溶出速率方法很多，如環(huán)糊精包裹、微乳、納米混懸液、表面活性劑增溶、納米脂質體、固體分散體、納米晶等[13]。藥物表觀溶解度的增加，并不都能促進藥物的透皮吸收，原因是在增加藥物表觀溶解度的同時導致藥物滲透性下降[14]。而固體分散技術通過維持藥物的過飽和狀態(tài)來增加其溶解度，較少出現(xiàn)藥物滲透性降低的情況[15]。

本研究中通過采用溶劑揮發(fā)法制備甲苯磺酸拉帕替尼固體分散體，使其表觀溶解度較陽性對照藥分別提高16.3 倍（1 ∶2 ∶1）、13.5 倍（1 ∶1 ∶1）、6.2 倍（1 ∶0.5 ∶0.5），再利用裸鼠乳腺癌模型評價其抑瘤作用。

圖3 MDA-MB-231 裸鼠移植瘤中HER2 表達量（×40）

表4 移植瘤中EGFR 和HER2 表達程度（± s，%，n=10）

表4 移植瘤中EGFR 和HER2 表達程度（± s，%，n=10）

組別A1 組A2 組A3 組B 組C 組EGFR 23.4±3.79#▲24.1±4.13#△26.3±3.56#29.0±3.90#36.4±4.89 HER2 11.1±5.68#△11.4±5.20#△14.7±6.22#17.6±6.12#23.5±6.32

乳腺癌的發(fā)展常與EGFR 和HER2 過表達相關[2]，甲苯磺酸拉帕替尼通過氫鍵可逆地結合到EGFR 和HER2 酪氨酸激酶ATP 結合位點上，阻止ArIP 結合到酪氨酸激酶區(qū)，抑制酪氨酸激酶的自磷酸化和激活，從而抑制腫瘤細胞增殖和凋亡[16]。本研究中比較了各組對EGFR 和HER2 的抑制效果，從分子水平分析了固體分散體技術的增效作用。高水溶性組和中水溶性組中EGFR 和HER2 的表達量分別為模型組的64.29% ～66.21%和47.23% ～48.51%，均顯著優(yōu)于TYKERB? 陽性對照組的79.67% 和74.89% （P ＜0.05）。與各組移植瘤的體積和瘤重變化結果吻合。這可能源于甲苯磺酸拉帕替尼表觀溶解度的提升，擴大了細胞膜滲透濃度梯度，促進了甲苯磺酸拉帕替尼的跨膜轉運吸收。