黃鵬飛(中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院，天津 300309)

0 引言

2019年12月新型冠狀病毒(SARS-CoV-2，簡(jiǎn)稱新冠病毒)引起的新型冠狀病毒性肺炎(COVID-19)在湖北省武漢市蔓延。在疫情爆發(fā)的早期，高通量測(cè)序是檢測(cè)病毒的主要手段，但是該檢測(cè)技術(shù)費(fèi)用昂貴，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)并且對(duì)儀器和操作員提出了很高的要求，無(wú)法滿足大規(guī)?？焖贆z測(cè)需求。實(shí)時(shí)熒光定量RNA 反轉(zhuǎn)錄與cDNA 聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用基于國(guó)內(nèi)外大流行病的經(jīng)驗(yàn)，可以高效、快速地完成病毒標(biāo)本的檢測(cè)，具有高靈敏度、高特異性、易于推廣的優(yōu)點(diǎn)，因此成為我國(guó)疫情防控的首要檢測(cè)手段。本文結(jié)合實(shí)踐對(duì)熒光定量RNA 反轉(zhuǎn)錄與cDNA 聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合的檢測(cè)方法的應(yīng)用進(jìn)行探討，并提出了生物實(shí)驗(yàn)研究、手術(shù)護(hù)理過(guò)程中的安全防護(hù)措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來(lái)源

2020年2月15日至2020年3月15日我院發(fā)熱門診室收治的763 位發(fā)熱患者。

1.1.2 試劑與儀器

試劑選用上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒和新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒。檢測(cè)儀器選用Bio-Rad伯樂(lè) CFX Connect 熒光定量PCR 儀。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

預(yù)約采樣，每日上午、下午分別采集一批樣本，由穿戴三級(jí)生物安全防護(hù)裝備的醫(yī)護(hù)人員采集患者的咽拭子，對(duì)于多次咽拭子檢測(cè)為陽(yáng)性或高度疑似的患者，進(jìn)一步采集痰液或肛門拭子。

1.2.2 樣本包裝、運(yùn)送及接收

收集樣品后，將其放入病毒存儲(chǔ)管中并冷凍，試管外貼條碼。用75%的乙醇噴灑樣品管后放在密封袋。每個(gè)包裝僅限存放一個(gè)樣品管。樣本由專門人員送到實(shí)驗(yàn)室。接待人員對(duì)箱子的外表面進(jìn)行消毒，用75%的乙醇噴灑運(yùn)輸樣品運(yùn)輸箱表面，將其打開(kāi)再對(duì)箱子進(jìn)行乙醇消毒。最后，取出樣品運(yùn)輸箱并在生物安全柜中打開(kāi)，檢查樣品數(shù)量是否正確，樣品管是否完好，有無(wú)破損泄漏。

1.2.3 提取樣本核酸

通過(guò)磁珠法提取核酸RNA，為擴(kuò)增核酸，使用新冠病毒開(kāi)放閱讀碼框(ORF1ab)和基因編碼核衣白核蛋白(N)基因特異性保守序列為靶區(qū)，構(gòu)建雙靶基因。與PCR 反應(yīng)溶液結(jié)合使用可以通過(guò)在定量PCR 熒光儀上改變熒光信號(hào)來(lái)進(jìn)行RNA 檢測(cè)。

1.2.4 檢測(cè)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)中使用的PCR 檢測(cè)系統(tǒng)包括內(nèi)源內(nèi)標(biāo)(IC)引物，可通過(guò)確定正常內(nèi)標(biāo)來(lái)監(jiān)控樣本采集、核酸提取及擴(kuò)增情況，有效減少假陰性檢測(cè)結(jié)果。在每個(gè)批次的實(shí)驗(yàn)中建立三個(gè)陰性質(zhì)量對(duì)照和一個(gè)關(guān)鍵的陽(yáng)性質(zhì)量對(duì)照，將它們隨機(jī)插入樣品中同時(shí)檢測(cè)，以監(jiān)控實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。分析結(jié)果時(shí)應(yīng)首先檢查陰性和陽(yáng)性質(zhì)量控制結(jié)果，陰性質(zhì)量控制品的FAM 和ROX 通道都沒(méi)有Ct 值或Ct 值大于40，陽(yáng)性質(zhì)量控品FAM，ROX 通道和內(nèi)標(biāo)通道HEX 的Ct 值小于等于35。如果質(zhì)控產(chǎn)品的結(jié)果滿足上述要求，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效，否則結(jié)果無(wú)效，需重新測(cè)試。

每個(gè)測(cè)試樣品的結(jié)果應(yīng)參考試劑盒說(shuō)明，分析結(jié)果如下：(1)如果FAM 或ROX 通道檢測(cè)出典型S 型擴(kuò)增曲線，Ct 值小于等于40，可以報(bào)告為樣品中SARS-CoV-2 核酸陽(yáng)性。(2)如果FAM和ROX 通道都未測(cè)得典型S 型擴(kuò)增曲線，無(wú)Ct 值或Ct 值大于40，HEX 通道測(cè)得S 型擴(kuò)增曲線，Ct 值小于等于40，則樣本可以判斷為SARS-CoV-2 樣本核酸陰性。(3)如果FAM、ROX、HEX通道均未測(cè)得典型S 型擴(kuò)增曲線，且沒(méi)有Ct 值或Ct 值大于 40，則表示樣本細(xì)胞含量低或反應(yīng)被抑制，樣品測(cè)試結(jié)果無(wú)效，需找到原因并消除，重新測(cè)試。

2 檢測(cè)過(guò)程中的安全防護(hù)

2.1 標(biāo)本采集過(guò)程中的安全防護(hù)

核酸檢測(cè)樣品包括上呼吸道樣品(如口咽拭子，鼻咽拭子等)，下呼吸道樣品(如痰液、呼吸道提取物、肺泡灌洗液等)，患者病癥發(fā)作期間的血液、糞便。收集樣品時(shí)應(yīng)該確保收集者配備生物安全三級(jí)防護(hù)設(shè)備。據(jù)統(tǒng)計(jì)最常用的咽拭子樣本核酸檢測(cè)準(zhǔn)確率、靈敏度較低，下呼吸道樣本檢測(cè)則陽(yáng)性率偏高。比較理想是檢測(cè)患者痰液，建議使用6 mL，3%生理鹽水霧化吸入20min，從下至上輕拍患者背部促使痰液排出。對(duì)于無(wú)法采集痰標(biāo)本的患者仍需要用咽拭子檢測(cè)核酸，但應(yīng)考慮影響核酸檢測(cè)的因素例如采集材料、采集深度等。

2.2 樣本轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的安全防護(hù)

收集樣品后，樣本試管外部用75%的乙醇噴灑消毒，將其放在專用雙層一次性密封袋中，再用75%的乙醇噴灑密封袋外表后將其放在轉(zhuǎn)運(yùn)箱(帶有生物安全標(biāo)志)中，對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)箱進(jìn)行消毒并立即送交檢查，整個(gè)過(guò)程必須在兩個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。工作人員隨身攜帶75%的乙醇以應(yīng)對(duì)突發(fā)事件。新冠病毒肺炎臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)生物安全防護(hù)指南指出在發(fā)生突發(fā)事件時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)工作人員不可自行處置轉(zhuǎn)運(yùn)箱，而應(yīng)與接收地點(diǎn)聯(lián)系以說(shuō)明情況并與接收人員協(xié)調(diào)處理。建議轉(zhuǎn)運(yùn)人員應(yīng)該隨時(shí)攜帶75%乙醇，如果運(yùn)輸箱的密封件發(fā)生損壞可以立即進(jìn)行緊急消毒處理，如果樣品泄漏，請(qǐng)到接收處與接收人員共同處理。

2.3 樣本接收過(guò)程中的安全防護(hù)

樣本接收人員應(yīng)配備二級(jí)生物安全保護(hù)裝備。在對(duì)樣品進(jìn)行雙重簽名驗(yàn)收操作后，接收人員要用75%乙醇對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)箱的外表面進(jìn)行噴灑消毒。然后將其靜置20 分鐘左右，輕輕開(kāi)啟轉(zhuǎn)運(yùn)箱，再次用75%乙醇對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)箱的內(nèi)部、密封袋進(jìn)行噴灑消毒。重點(diǎn)檢查樣本轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中是否發(fā)生泄漏，以及核對(duì)樣本來(lái)源信息是否正確，如患者個(gè)人信息，然后將樣本放入儲(chǔ)藏盒中，并在4℃專用冰箱中進(jìn)行存儲(chǔ)，存儲(chǔ)時(shí)間不能大于24h。對(duì)于血漿樣本可以在4℃下最長(zhǎng)存儲(chǔ)3 天，在-20℃下可以長(zhǎng)期保存。應(yīng)當(dāng)記錄樣本收集、轉(zhuǎn)運(yùn)、接收環(huán)節(jié)的信息，以方便進(jìn)行跟蹤。

3 醫(yī)護(hù)過(guò)程中的安全防護(hù)

3.1 手術(shù)間的安全防護(hù)

要嚴(yán)格按照治療傳染病的相關(guān)程序，新冠病毒肺炎患者或疑似病例正在接受手術(shù)時(shí)，手術(shù)室應(yīng)是充分消毒的負(fù)壓手術(shù)室，負(fù)壓前后室門禁止和手術(shù)間門同啟。手術(shù)完成后要關(guān)閉負(fù)壓，并消毒。

3.2 醫(yī)護(hù)人員、患者的個(gè)人安全防護(hù)

3.2.1 提高醫(yī)護(hù)人員防護(hù)意識(shí)

通過(guò)一定的措施強(qiáng)化醫(yī)護(hù)人員對(duì)新冠病毒的安全防護(hù)意識(shí)，使其可以主動(dòng)進(jìn)行安全發(fā)防護(hù)，積極學(xué)習(xí)安全管理規(guī)章制度，包括手衛(wèi)生、醫(yī)療廢棄物處理、消毒和隔離系統(tǒng)、標(biāo)準(zhǔn)化安全防護(hù)裝備穿戴和拆除、使用負(fù)壓手術(shù)室操作、清潔通道的位置布局。

加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員穿戴和脫除安全防護(hù)裝備的培訓(xùn)，確保醫(yī)護(hù)人員掌握防護(hù)裝備的穿脫方法。

在手術(shù)前醫(yī)護(hù)人員要做好自我檢查，如果發(fā)現(xiàn)雙手有皮膚損傷，應(yīng)避免參加手術(shù)。如果必須參與手術(shù)則應(yīng)該受到特別保護(hù)。在新冠病毒肺炎患者手術(shù)過(guò)程中，如果醫(yī)護(hù)人員身體處于抵抗力較低的時(shí)期，則禁止上手術(shù)臺(tái)。

3.2.2 合理排班保證醫(yī)護(hù)人員體力

合理安排醫(yī)護(hù)人員工作，對(duì)孕婦、哺乳期婦女，原則上不安排參加新冠病毒患者手術(shù)。創(chuàng)建具有內(nèi)部和外部明確分工的護(hù)士和麻醉師。內(nèi)部巡查護(hù)士、洗手護(hù)士、麻醉師主要負(fù)責(zé)對(duì)手術(shù)室中的患者進(jìn)行治療護(hù)理，手術(shù)期間禁止越過(guò)規(guī)定區(qū)域以減少污染物擴(kuò)散。外部巡查護(hù)士、外部麻醉師主要負(fù)責(zé)產(chǎn)品和藥品的供應(yīng)。平時(shí)要保證醫(yī)護(hù)人員的休息時(shí)間，加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)。

3.2.3 規(guī)范轉(zhuǎn)移患者

在將患者送入送出手術(shù)室的過(guò)程中，為盡量減少患者轉(zhuǎn)移過(guò)程中的污染，因該給意識(shí)清醒、呼吸受限的患者佩戴口罩。氣管插管患者氣管導(dǎo)管接口應(yīng)連接病毒細(xì)菌過(guò)濾器，整個(gè)過(guò)程使用密封式轉(zhuǎn)運(yùn)車轉(zhuǎn)運(yùn)。

3.2.4 做好手術(shù)中的防護(hù)

在開(kāi)始手術(shù)之前，醫(yī)護(hù)人員必須采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施，都應(yīng)穿著防護(hù)服，佩戴N95 口罩、醫(yī)用手套，還應(yīng)穿鞋套。手術(shù)完成后嚴(yán)格按照規(guī)定在指定位置脫下防護(hù)服，以免造成二次污染。必須嚴(yán)格遵守手術(shù)無(wú)菌原則、消毒隔離要求進(jìn)行嚴(yán)格消毒。

3.3 終末消毒

環(huán)境與物體表面消毒。清潔人員也要穿戴標(biāo)準(zhǔn)化防護(hù)裝備，用1mg/mL 氯消毒液擦拭物體表面。

手術(shù)室內(nèi)物品消毒。被血液或其他分泌物沾染的物品必須用含2mg/mL 氯的消毒布擦拭，其余的要用含1mg/mL 的消毒布擦拭，然后再用清水擦拭。手術(shù)室的地板和墻壁上有血跡或分泌物，必須噴灑2mg/mL 的含氯消毒劑并浸泡0.5h 后再用清水擦拭，其余地板、墻壁、天花板要用1mg/mL 的氯來(lái)擦拭。

手術(shù)室消毒，打開(kāi)負(fù)壓層流0.5h，然后關(guān)閉層流，并使用含3%過(guò)氧化氫的蒸汽熏蒸噴霧劑對(duì)手術(shù)室中的空氣進(jìn)行消毒，再密閉兩個(gè)小時(shí)后打開(kāi)層流通風(fēng)流動(dòng)并用清水擦拭物品表面以防腐蝕。

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)分析新冠病毒檢測(cè)樣本的收集、轉(zhuǎn)運(yùn)、接收、核酸提取過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題，提出了明確的檢測(cè)依據(jù)，對(duì)于確保新冠病毒核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有其重要作用，同時(shí)探討了樣本收集、轉(zhuǎn)運(yùn)、接收中及醫(yī)護(hù)過(guò)程中的安全防護(hù)。目前，對(duì)于COVID-19 的發(fā)病機(jī)制、臨床發(fā)病過(guò)程、治療方案仍在持續(xù)研究中。作為一種診斷方法，病毒核酸檢測(cè)仍是一種快速、可靠、必不可少的檢測(cè)方法。為了進(jìn)一步提高核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確度和速度，需要提高檢測(cè)試劑盒的穩(wěn)定性。目前很多研究人員還在積極探索更有效的檢測(cè)方法，例如數(shù)字PCR，這將有助于更快、更準(zhǔn)地檢測(cè)新冠病毒，在控制疾病進(jìn)程、實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早治療以及有效預(yù)防控制疫情中起到非常關(guān)鍵的作用。