劉 毅 葉穎曉 阮 元 劉 淼 麻兵繼*

（1.安慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系， 安徽安慶246052； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 河南鄭州450000）

植物內(nèi)生真菌指的是生活在健康植物組織間隙或植物細(xì)胞內(nèi)且不會引起宿主明顯的感染癥狀的真菌。植物內(nèi)生真菌種類多、分布廣，還能夠產(chǎn)生多種多樣的活性天然產(chǎn)物［1?2］。內(nèi)生真菌長期生活在寄主植物體內(nèi)，與寄主植物及周圍的環(huán)境形成復(fù)雜和諧的互利共生體系，其分布存在特異性，可以產(chǎn)生與寄主植物相似的代謝產(chǎn)物，也可以獨立產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，并賦予宿主植物抵抗生物、非生物的脅迫作用［3?4］。

三七Panax notoginsengBurk.F.H.Chen 為五加科植物，其干燥根及根莖入藥，具有散瘀止血、消腫定痛的功效［5］，現(xiàn)代研究表明三七主要含有三七素、糖類、皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油和氨基酸等成分。目前已從多株三七內(nèi)生真菌中分離得到結(jié)構(gòu)新穎的聚酮類以及N?苯甲酰氨基酸類化合物，其中聚酮苷類化合物具有抗腫瘤、抗病毒活性［6?8］，新的N?苯甲酰氨基酸類化合物對三七致病真菌顯示一定的抗真菌活性［9］。有研究報道從三七內(nèi)生真菌Cladosporium sp.的液體培養(yǎng)提取物中分離得到吡咯烷?二酮類化合物［10］，顯示有輕微的抗甲型H1N1 流感病毒活性。本研究對三七內(nèi)生真菌Cladosporium sp.化學(xué)成分進(jìn)行研究，以期在其固體發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎且活性顯著的次生代謝產(chǎn)物。

1 材料

德國Bruker 600 MHz 超導(dǎo)核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）；1260 高效效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；NP700C 半制備高效液相色譜儀（江蘇漢邦科技有限公司）；EYELA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（埃朗科技國際貿(mào)易有限公司）；LDZX?75KBS 高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SW?CJ?2FBC超凈工作臺 （蘇州智凈凈化儀器有限公司）；HNY?211B 恒溫?fù)u床（天津歐諾儀器股份有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。葡聚糖凝膠Sephadex LH?20 （瑞典Ge Healthcare 公司）；硅膠材料和薄層層析板（青島海洋化工有限公司）；制備薄層層析硅膠板（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）。

石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等有機試劑（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；丙酮（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜級，美國Fisher Scientific 公司）；氘代甲醇、氘代氯仿（美國Cambridge Isotope Laboratories 公司）。

三七內(nèi)生真菌Cladosporium sp.，菌種由中南民族大學(xué)藥學(xué)院楊小龍教授實驗室提供并鑒定。將菌株Cladosporium sp.接種至PDA （馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基） 上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，然后將0.5 cm×0.5 cm 的菌塊接種到PDB （馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基） 中，以28 ℃，160 r／min 的培養(yǎng)條件培養(yǎng)5 d，作種子液備用。分別將每10 mL 種子液接種到盛有經(jīng)滅菌后的100 g 大米＋100 mL MEB （麥芽糖浸粉肉湯固體培養(yǎng)基，內(nèi)含蔗糖20 g／L、麥芽提取物20 g／L、蛋白胨1 g／L）中，恒溫靜置發(fā)酵培養(yǎng)35 d。

2 提取與分離

用甲醇?二氯甲烷（1 ∶1） 室溫浸泡固體發(fā)酵物3 d，期間超聲提取3 次，提取液經(jīng)減壓濃縮回收溶劑得浸膏。按體積比1 ∶1 加水后加入2 倍量的乙酸乙酯進(jìn)行萃取3 次，得乙酸乙酯浸膏80 g。

用二氯甲烷／甲醇（100 ∶1～0 ∶1） 對浸膏進(jìn)行柱層析梯度洗脫，得9 個組分Fr.1?9。Fr.2 經(jīng)硅膠柱層析純化得到Fr.2.1、Fr.2.2 和Fr.2.3 3個亞組分，F(xiàn)r.2.1 析出化合物1 （35 mg）；Fr.2.2 再經(jīng)硅膠柱層析和Sephadex LH?20 凝膠柱層析得到化合物2 （11.3 mg）、3 （34.7 mg）、4（18 mg）；Fr.3 經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH?20 凝膠柱層析和半制備HPLC 分別得到化合物5（3.3 mg）、6 （3.5 mg）；Fr.5 經(jīng)硅膠柱層析后再經(jīng) Sephadex LH?20 凝膠柱層析得化合物 7（9.4 mg）；Fr.6 經(jīng)薄層制備、Sephadex LH?20 凝膠柱層析得化合物8 （4.5 mg）、9 （7 mg）；Fr.8經(jīng)硅膠柱層析得到化合物10 （4 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1： 無色晶體，分子式C28H44O，EI?MSm／z： 396.2 ［M］＋。1H?NMR （600 MHz，CDC13）δ：5.77 （1H，dd，J＝2.5，5.5 Hz，H?6），5.39 （1H，m，H?7），5.21 （2H，m，H?22，H?23），3.64 （1H，m，H?3）；13C?NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 141.4（C?5），139.8 （C?8），135.5 （C?23），131.9 （C?22），119.6 （C?6），116.2 （C?7），70.4 （C?3），55.7 （C?17），54.5 （C?14），46.2 （C?9），42.8 （C?13，C?24），40.7 （C?4），40.4 （C?16，C?20），39.0（C?1），38.4 （C?10），33.1 （C?25），31.9 （C?2），23.0 （C?15），21.1 （C?11，C?27），19.9 （C?21，C?26），19.6 （C?12），17.6 （C?28），16.3 （C?19），12.0 （C?18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］ 一致，故鑒定為3β ?羥基?麥角甾?5，7，22?三烯。

化合物2： 無色晶體，分子式C28H44O3，EI?MSm／z：428.1 ［M］＋。1H?NMR （600 MHz，CDC13）δ： 6.48 （1H，d，J＝8.3 Hz，H?7），6.22 （1H，d，J＝8.3 Hz，H?6），5.20 （1H，dd，J＝7.5，15.2 Hz，H?23），5.10 （1H，dd，J＝7.5，15.2 Hz，H?22），3.95 （1H，m，H?3）；13C?NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 135.4 （C?6），135.2 （C?7），132.3 （C?23），130.7 （C?22），82.1 （C?5），79.4 （C?8），66.4 （C?3），56.1 （C?17），51.6 （C?14），51.0 （C?9），44.5（C?13），42.7 （C?24），39.7 （C?20），39.3 （C?12），36.9 （C?4），34.6 （C?1），33.0 （C?25），30.1（C?2），28.6 （C?16），23.4 （C?11），20.9 （C?21），20.6 （C?15），19.9 （C?26），19.6 （C?27），18.2（C?19），17.5 （C?28），12.8 （C?18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］ 一致，故鑒定為3β?羥基?5α，8α?過氧化麥角甾?6，22?二烯。

化合物3： 無色油狀，分子式C18H32O2，EI?MSm／z： 280.2 ［M］＋。1H?NMR （600 MHz，CDCl3）δ： 5.45 （4H，m，H?9，10，12，13），2.79 （2H，m），2.36 （2H，t，J＝7.2 Hz，H?2），2.05 （2H，m，H?14），2.10 （2H，m，H?8）；13C?NMR （151 MHz，CDCl3）δ： 180.0 （C?1），130.2 （C?13），130.0 （C?9），128.0 （C?10），127.9 （C?12），34.1 （C?2），31.5 （C?16），29.6 （C?7），29.3 （C?15），29.2 （C?4），29.2 （C?5），29.1 （C?6），27.2 （C?8），27.2（C?14），25.7 （C?11），25.5 （C?3），22.6 （C?17），14.1 （C?18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］ 一致，故鑒定為亞油酸。

化合物4： 無色針晶，分子式C28H40O，EI?MSm／z： 392.3 ［M］＋。1H?NMR （600 MHz，CDCl3）δ：6.61 （1H，d，J＝9.2 Hz，H?6），6.03 （1H，d，J＝9.5 Hz，H?7），5.74 （1H，s，H?4），5.26 （1H，dt，J＝7.7，15.1 Hz，H?22），5.21 （1H，dt，J＝9.1，15.1 Hz，H?23），1.70 （1H，m，H?11a），1.61（1H，m，H?11b），1.50 （1H，m，H?16b），1.49（1H，t，J＝5.9 Hz，H?25），1.29 （2H，m，H?12），1.26 （1H，m，H?17），1.06 （3H，d，J＝6.1 Hz，H?21），1.00 （3H，s，H?19），0.97 （3H，s，H?18），0.94 （3H，d，J＝7.0 Hz，H?28），0.88 （3H，d，J＝6.3 Hz，H?27），0.85 （3H，d，J＝6.3 Hz，H?26）；13C?NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 199.6 （C?3），164.4 C?5），156.1 （C?14），135.0 （C?22），134.0 （C?7），132.5 （C?23），124.4 （C?8），122.9（C?4），55.6 （C?17），44.2 （C?9），44.0 （C?13），42.8 （C?24），39.3 （C?20），36.7 （C?10），35.5（C?12），34.1 （C?2），33.1 （C?25），27.7 （C?16），25.3 （C?15），21.2 （C?21），20.0 （C?26），19.6（C?27），18.9 （C?18），17.6 （C?28），16.6 （C?19）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］ 一致，故鑒定為麥角甾?4，6，8 （14），22?四烯?3?酮。

化合物5： 無色片狀晶體，分子式C9H8O2，F(xiàn)AB??MSm／z： 147.2 ［M?H］?。1H?NMR （600 MHz，CH3OD）δ： 7.69 （1H，s，J＝16.0 Hz，H?7），7.59（2H，m，J＝6.5，3.0 Hz，H?2，6），7.41 （1H，m，H?4），7.40 （2H，d，J＝3.6 Hz，H?3，5），6.49（1H，d，J＝16.0 Hz，H?8）；13C?NMR （150 MHz，CH3OD）δ： 170.4 （C?9），146.3 （C?7），135.8 （C?1），131.4 （C?4），130.0 （C?3，C?5），129.2 （C?2，C?6），119.4 （C?8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］ 一致，故鑒定為肉桂酸。

化合物6： 白色粉末，分子式C16H14O6，EI?MSm／z： 302.2 ［M］＋。1H?NMR （600 MHz，CDCl3）δ： 11.87 （1H，s，H?18），7.28 （1H，d，J＝2.0 Hz，H?8），6.72 （1H，s，H?3），6.56 （1H，d，J＝2.0 Hz，1?H），3.98 （3H，s，CH3?15），3.92 （3H，s，CH3?19），2.78 （3H，s，CH3?17）；13C?NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 166.6 （C?6），165.4 （C?11），164.7 （C?13），147.0 （C?2），140.0 （C?8），138.2（C?10），131.8 （C?7），127.4 （C?4），112.4 （C?12），111.4 （C?9），105.3 （C?5），99.3 （C?3），99.2 （C?1），56.4 （C?19），55.9 （C?15），25.6 （C?17）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］ 一致，故鑒定為3，10?二羥基?4，8?二甲氧基?6?甲基苯甲香豆素。

化合物7： 白色粉末，分子式C9H8O3，F(xiàn)AB-?MSm／z： 163.1 ［M?H］?。1H?NMR （600 MHz，CH3OD）δ： 7.61 （1H，d，J＝16.0 Hz，H?7），7.44（2H，d，J＝8.5 Hz，H?2，6），6.82 （2H，d，J＝8.5 Hz，H?3，5），6.28 （1H，d，J＝16.0 Hz，H?8）；13C?NMR （150 MHz，CH3OD）δ： 171.0 （C?9），161.2 （C?4），146.6 （C?7），131.1 （C?2，C?6），127.2 （C?1），116.8 （C?3，C?5），115.6 （C?8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［17］ 一致，故鑒定為對p?香豆酸。

化合物8： 無色油狀，分子式C6H12O4，EI?MSm／z： 130.3 ［M］＋。1H?NMR （600 MHz，CDCl3）δ：4.54 （1H，ddd，J＝11.2，8.4，6.5 Hz，H?5a），4.28 （1H，dt，J＝11.2，4.6 Hz，H?5b），2.60（1H，d，J＝17.5 Hz，H?2a），2.43 （1H，d，J＝17.5 Hz，H?2b），1.84 （2H，dd，J＝7.5，5.0 Hz，H?4a，4b），1.31 （3H，s，CH3?6）；13C?NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 171.3 （C?1），67.7 （C?3），66.2（C?5），44.4 （C?2），35.5 （C?4），29.3 （C?6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］ 一致，故鑒定為R?甲瓦龍酸內(nèi)酯。

化合物9： 白色粉末，分子式C10H8N2O2，EI?MSm／z： 188.2 ［M］＋。1H?NMR （600 MHz，CH3OD）δ： 8.73 （1H，s，H?2），8.32～8.29 （1H，m，H?4），7.49～7.47 （1H，m，H?7），7.27 （1H，dd，J＝6.0，1.1 Hz，），7.25 （1H，m，J＝6.0，1.1 Hz，）；13C?NMR （151 MHz，CH3OD）δ： 183.1 （C?8），168.2 （C?9），139.4 （C?2），138.0 （C?7a），127.9 （C?3a），124.8 （C?6），123.8 （C?5），123.0（C?4），114.0 （C?7），113.1 （C?3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］ 一致，故鑒定為（1H?indol?3?yl） ?oxoac?etamide。

化合物10： 淺黃色油狀，分子式C18H32O4，EI?MSm／z： 312.1 ［M］＋。1H?NMR （600 MHz，CDCl3）δ：5.59 （1H，dt，J＝11.0，7.6 Hz，H?10），5.46～5.35 （2H，m，H?14，H?9），5.30 （1H，ddd，J＝6.1，5.2，4.4 Hz，H?13），4.27～4.16 （1H，m，H?8），3.45 （2H，dd，J＝11.0，5.0 Hz，H?7），2.93～2.78 （2H，m，H?11 H?12），2.34 （2H，t，J＝7.3 Hz，H?2），2.04 （2H，dd，J＝14.6，7.3 Hz，H?15），1.54～1.14 （18H，m）；13C?NMR （150 MHz，CDCl3）δ： 178.8 （C?1），133.3 （C?10），131.2 （C?13），128.5 （C?9），126.5 （C?12），74.8（C?7），71.1 （C?8），33.9 （C?2），32.4 （C?6），31.5 （C?16），29.7 （C?15），29.2 （C?4），28.9 （C?14），26.3 （C?11），25.2 （C?15），24.5 （C?3），22.6 （C?17），14.1 （C?18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［20］ 一致，故鑒定為7，8?dihydroxy?9，12 （Z，Z） ?octadecadienoic acid。

4 討論

本實驗從三七內(nèi)生真菌Cladosporium sp.大米固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離并鑒定了10 個化合物，含有脂肪酸類、麥角甾類、香豆素類、酚酸類和吲哚類，其中化合物5～9 均為首次從該內(nèi)生真菌中分離得到；化合物5 是重要的化工原料，合成藥物的中間體；化合物7 具有抗氧化、抗腫瘤、保護心血管及神經(jīng)保護作用［21］；化合物8 有助于修復(fù)受損的角質(zhì)層，具有良好的抗衰老功能，是各類護膚品的重要成分之一。另外，本實驗沒有分離獲得到文獻(xiàn)報道的同屬來源真菌中所得的大環(huán)內(nèi)酯類［22］、聚酮類［23］化合物，其原因可能是菌種來源和培養(yǎng)條件的差異影響了內(nèi)生真菌基因的表達(dá)，進(jìn)而影響其次生代謝產(chǎn)物種類。因此，在內(nèi)生菌次級代謝產(chǎn)物的研究中，可以通過改變培養(yǎng)條件以及表觀遺傳修飾等手段進(jìn)行優(yōu)化發(fā)酵過程，以期得到更多有活性的新化合物。