關(guān)滄海， 趙俞喬， 郭 靚， 陳雨竹， 王微娜， 姜興明

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150086）

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類廣泛存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、長(zhǎng)度在200 nt 以上、缺少開放閱讀框、不參與或很少參與蛋白質(zhì)編碼、主要從蛋白編碼基因的反義鏈及間隔區(qū)轉(zhuǎn)錄出來(lái)的RNA［1-6］。已有大量研究證實(shí)，lncRNA涉及調(diào)控多種生物學(xué)功能，比如細(xì)胞增殖、凋亡及血管生成［7-9］。表達(dá)異常的lncRNA與諸多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10-11］。lncRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑改變細(xì)胞周期和增殖免疫等在諸多腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌的作用［12-15］。MNX1 反義RNA 1（MNX1 antisense RNA 1，MNX1-AS1）是一種新發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的lncRNA。

1 MNX1-AS1概述

MNX1-AS1 全長(zhǎng) 5 568 nt，位于 7 號(hào)染色體長(zhǎng)臂 3區(qū)6 帶（7q36），鄰近MNX1 蛋白編碼基因的5'端，又稱結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本5（colon cancer associated transcript 5，CCAT5）；NR_038835.1 是 MNX1-AS1 唯一的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，含有2 個(gè)外顯子。目前研究表明，MNX1-AS1可以借助競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機(jī)制與miRNA 相互作用，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控；誘導(dǎo)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，加快腫瘤的生長(zhǎng)；促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及激活 AKT/mTOR等多種信號(hào)通路來(lái)調(diào)控肺腺癌、乳腺癌和肝細(xì)胞癌等諸多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

2 MNX1-AS1與惡性腫瘤

2.1 肺腺癌 大量研究表明，MNX1-AS1 在肺腺癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，高表達(dá)MNX1-AS1 患者的瘤體更大，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生概率更高，并且總生存時(shí)間（overall survival，OS）更短，從Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的分析數(shù)據(jù)來(lái)看，MNX1-AS1 的定量檢測(cè)可以作為肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立判斷因素［16-17］。通過(guò)轉(zhuǎn)染特異性siRNA 下調(diào)MNX1-AS1 表達(dá)后能夠顯著抑制A549 和SPC-A1 腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。進(jìn)一步研究證實(shí) MNX1-AS1和BRF2 的末端序列 CUUUGCA 與miR-527 的種子序列GAAACGU 存在互補(bǔ)；肺腺癌組織中MNX1-AS1與miR-527的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，而與BRF2 的表達(dá)呈正向相關(guān)；預(yù)先反向上調(diào)miR-527或下調(diào)BFR2 的表達(dá)都可以逆轉(zhuǎn)MNX1-AS1 過(guò)表達(dá)所致的促癌作8 用［18］。上述研究結(jié)果提示：異常高表達(dá)的MNX1-AS1 對(duì)肺腺癌增殖與侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)是通過(guò)ceRNA機(jī)制調(diào)控miR-527/BRF2軸來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

2.2 胃癌 對(duì)96 例胃癌患者的腫瘤組織和臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，MNX1-AS1 在腫瘤組織中異常高表達(dá)，MNX1-AS1 的表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM 分期、長(zhǎng)期生存情況以及預(yù)后密切相關(guān)。敲減 MNX1-AS1 后胃癌細(xì)胞 AGS和MGC-803 的增殖、侵襲和遷移能力受到抑制，其機(jī)制是沉默MNX1-AS1 能夠抑制反映細(xì)胞增殖能力的增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、EMT 相關(guān)蛋白神經(jīng)鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）以及與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表達(dá)［19］。此外，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）可以抑制CDK 活性，防止關(guān)鍵CDK 底物的磷酸化，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，Ma等［20］證實(shí)異常高表達(dá)的MNX1-AS1可以通過(guò)抑制CDKN1A 來(lái)促進(jìn)胃癌的侵襲和遷移。由此可見，MNX1-AS1 對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控可以通過(guò)PCNA、EMT 和細(xì)胞周期途徑，然而MNX1-AS1 是否可以借助ceRNA機(jī)制促進(jìn)胃癌有待進(jìn)一步研究。

2.3 結(jié)腸癌 結(jié)腸癌中MNX1-AS1 呈異常高表達(dá)，并且其表達(dá)水平不僅與淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)，同時(shí)還可作為結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MNX1-AS1 的結(jié)腸癌細(xì)胞 HT29 在 490 nm 波長(zhǎng)測(cè)得的吸光度值更高，并且進(jìn)入Transwell 下室的細(xì)胞不僅數(shù)目更多，侵入速度也明顯加快。通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)以及qRT-PCR 檢測(cè)出miR-218-5p 是在MNX1-AS1 被沉默后顯著表達(dá)的miRNA，miR-218-5p 下游靶基因SEC61 易位子 α1 亞基（SEC61 translocon alpha 1 subunit，SEC61A1）在結(jié)腸癌明顯高表達(dá)。進(jìn)一步利用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-218-5p 與上述兩者存在靶向作用關(guān)系，并且沉默MNX1-AS1 對(duì)結(jié)腸癌的抑癌作用可以被下調(diào)miR-218-5p 或過(guò)表達(dá)SEC61A1 所逆轉(zhuǎn)。同時(shí)，研究人員還預(yù)測(cè)出轉(zhuǎn)錄因子E2F1與MNX1-AS1的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，但缺少更進(jìn)一步的分子細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)［21］。另有研究證實(shí)，過(guò)表達(dá)的MNX1-AS1 能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29 和SW620 中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的表達(dá)，從而調(diào)控結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展［22］。上述研究結(jié)果提示，異常高表達(dá)的MNX1-AS1 不僅可以借助miR-218-5p/SEC61A1 軸，還能激活STAT3 信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖、遷移和侵襲，而MNX1-AS1的上游調(diào)控機(jī)制有待后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

2.4 肝細(xì)胞癌 對(duì)81 例肝細(xì)胞癌患者的腫瘤組織和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行定量檢測(cè)及分析，觀察到MNX1-AS1在腫瘤組織中的表達(dá)明顯上調(diào)并且其表達(dá)水平與患者臨床高分期、出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及OS 呈顯著負(fù)相關(guān)。MTT、劃痕和Transwell 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，敲減MNX1-AS1后 Huh7和SMMC-7721 肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力得到增強(qiáng)；裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，沉默MNX1-AS1能夠減緩體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，導(dǎo)致瘤體更小。為進(jìn)一步研究MNX1-AS1促癌的作用機(jī)制，研究人員首先預(yù)測(cè)出MNX1-AS1 與COMMD8（COMM domain containing 8）的 3'UTR 序 列 AAGCACAA 和miR-218-5p 的種子序列UUGUGCUU 之間存在互補(bǔ)；抗Ago2的RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明，Ago2更容易與上述三者結(jié)合沉淀，并且在肝細(xì)胞癌組織中miR-218-5p與MNX1-AS1、和COMMD8的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)；轉(zhuǎn)染 sh-MNX1-AS1 對(duì) Huh7和SMMC-7721 細(xì)胞增殖和侵襲遷移的抑制作用能被過(guò)表達(dá)COMMD8 逆轉(zhuǎn)［23］。由此可見，MNX1-AS1能夠作為“分子海綿”內(nèi)源性吸附miR-218-5p，阻斷其與COMMD8 3'UTR 之間的結(jié)合，從而抑制肝細(xì)胞癌的惡性生物學(xué)行為。

2.5 食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous-cell carcinoma，ESCC） 在ESCC 患者的腫瘤組織中MNX1-AS1 的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，MNX1-AS1 高表達(dá)組患者的5 年生存率更低。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí) ，轉(zhuǎn) 染 si-MNX1-AS1 后 ESCC 細(xì) 胞 系 KYSE30 和KYSE150的細(xì)胞周期被阻滯，并且細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移也受到抑制。隨后的研究表明，MNX1-AS1和miR-34a 存在靶向結(jié)合位點(diǎn)并且兩者表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)；沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）在ESCC 組織中高表達(dá)，并且轉(zhuǎn)染si-MNX1-AS1和miR-34a inhibitor 后 的 KYSE30 細(xì) 胞中SIRT1 的表達(dá)分別受到抑制和促進(jìn)［24］。換言之，MNX1-AS1 可以通過(guò) miR-34a/SIRT1 軸對(duì) ESCC 進(jìn)行調(diào)控。然而上述研究沒有證明miR-34a 和SIRT1 是否存在靶向作用關(guān)系，對(duì)于MNX1-AS1 是否借助ceRNA 機(jī)制或是其他途徑影響SIRT1 的表達(dá)有待后續(xù)研究。此外，胰島素樣生長(zhǎng)因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）是ESCC 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的促癌基因。Zheng 等［25］的研究結(jié)果表明，上調(diào) MNX1-AS1 可以促進(jìn) ESCC 細(xì)胞系 TE-1 中 IGF2 的表達(dá)，進(jìn)而加快ESCC的遷移和侵襲進(jìn)程。

2.6 乳腺癌 通過(guò)qRT-PCR 和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析36 例乳腺癌腫瘤組織樣本和病理學(xué)數(shù)據(jù)，觀察到MNX1-AS1在乳腺癌組織中異常高表達(dá)，其表達(dá)水平不僅與組織學(xué)分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移和TNM 分期密切相關(guān)，而且還可以用來(lái)評(píng)估患者的預(yù)后。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染siRNA-MNX1-AS1 的 MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞的A值更小，劃痕條帶的間距更寬并且穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)目更少。為探明MNX1-AS1 通過(guò)何種機(jī)制促進(jìn)乳腺癌的增殖和侵襲遷移，Cheng等［26］對(duì)過(guò)表達(dá) MNX1-AS1 后乳腺癌細(xì)胞 AKT/mTOR通路（促進(jìn)細(xì)胞增殖）和EMT途徑的相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) p-AKT、p-mTOR 及其下游的 CDK4、Bcl-2、cyclin D1和c-Myc明顯高表達(dá)，且加快腫瘤侵襲和遷移的間充質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cadherin、Snail和Slug的表達(dá)上調(diào)。上述結(jié)果表明，乳腺癌中異常高表達(dá)的MNX1-AS1 通過(guò)對(duì) AKT/mTOR 信號(hào)通路和 EMT 的調(diào)控來(lái)促進(jìn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為。

2.7 骨肉瘤 研究表明MNX1-AS1 在骨肉瘤中表達(dá)顯著上調(diào)；Kaplan-Meier 分析結(jié)果顯示MNX1-AS1的表達(dá)水平與患者的總生存期呈顯著負(fù)相關(guān)；單因素和多因素分析表明定量檢測(cè)MNX1-AS1 可以對(duì)骨肉瘤患者的預(yù)后情況進(jìn)行判斷。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染siRNA-MNX1-AS1 后骨肉瘤細(xì)胞Saos-2 的增殖和侵襲能力受到抑制。研究MNX1-AS1 促癌機(jī)制的過(guò)程中檢測(cè)到吻素1（kisspeptin-1，KISS1）不僅在骨肉瘤組織中顯著低表達(dá)，而且與MNX1-AS1 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，于是作者得到MNX1-AS1 通過(guò)負(fù)向調(diào)控KISS1 來(lái)增強(qiáng)骨肉瘤的增殖和侵襲的結(jié)論，然而該研究團(tuán)隊(duì)缺少KISS1 相關(guān)表型實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證明其在骨肉瘤起到的促癌作用［27］。另有研究證實(shí)，骨肉瘤中 N-cadherin和Snail 受 MNX1-AS1 表達(dá)的調(diào)控，通過(guò)誘導(dǎo)上述兩者高表達(dá)來(lái)增進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而加速骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展［28］。此外，在骨肉瘤細(xì)胞U20S 中檢測(cè)出MNX1 的表達(dá)顯著上調(diào)并受到MNX1-AS1的正向調(diào)控，然而這種調(diào)控作用是否能夠促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展以及何種機(jī)制有待深入研究。

2.8 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM） 對(duì)44例GBM 患者的組織和臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行qRT-PCR 定量檢測(cè)及分析：MNX1-AS1 在GBM中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，其表達(dá)水平可以作為患者整體生存情況的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體上調(diào)MNX1-AS1 后U251 和T98 腫瘤細(xì)胞的吸光度增加、遷移和侵襲加快，而上述惡性生物學(xué)行為在沉默MNX1-AS1 的情況下可以被抑制。對(duì)MNX1-AS1 促癌作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，首先通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)出MNX1-AS1 和miR-4443 存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，共轉(zhuǎn)染MNX1-AS1-WT 與miR-4443 mimics 后螢光素酶活性顯著降低；miR-4443在GBM組織和T98細(xì)胞中明顯低表達(dá)，上調(diào)miR-4443 的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲遷移；沉默MNX1-AS1 對(duì)GBM 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用明顯強(qiáng)于共轉(zhuǎn)染shRNA-MNX1-AS1和 miR-4443 inhibitor 的腫瘤細(xì)胞［29］。因此，MNX1-AS1 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的調(diào)控是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-4443來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

2.9 其他腫瘤 MNX1-AS1 在卵巢癌呈異常高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與患者淋巴轉(zhuǎn)移、FIGO 分期高及5年生存率差顯著正相關(guān)，MNX1-AS1的定量檢測(cè)可以評(píng)估和預(yù)測(cè)患者的整體生存情況。CCK-8、Transwell 和流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1載體外源性上調(diào)MNX1-AS1 后更多的卵巢癌細(xì)胞（OVCA433 和SKOV-3）進(jìn)入S 期并且其凋亡發(fā)生受抑制，進(jìn)而增強(qiáng)卵巢癌的增殖和侵襲遷移能力；沉默MNX1-AS1 后可以得到與上述相反的結(jié)果［30-31］。然而目前卵巢癌中MNX1-AS1的促癌機(jī)制還不明確。

宮頸癌中異常高表達(dá)的MNX1-AS1 與腫瘤大小、血管侵襲、FIGO 分期及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。過(guò)表達(dá)MNX1-AS1 能夠促進(jìn)E6E7 細(xì)胞的增殖，而敲減MNX1-AS1 后測(cè)得 HeLa 細(xì)胞的A值降低；凋亡實(shí)驗(yàn)和Western blot 的結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)的MNX1-AS1 通過(guò)促進(jìn)Bcl-2、抑制Bax 的表達(dá)來(lái)抑制凋亡發(fā)生。MAPK 信號(hào)通路與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為證明MNX1-AS1 是否通過(guò)激活此通路起到促癌作用，研究人員首先在MNX1-AS1 過(guò)表達(dá)的E6E7 細(xì)胞中檢測(cè)到MAPK 通路相關(guān)蛋白p-ERK1/2 和p-JNK 呈高表達(dá)，隨后利用ERK1/2 和JNK1/2 的抑制劑SCH772984和SP600125證實(shí)阻斷MAPK 信號(hào)通路能夠逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)的MNX1-AS1 對(duì)宮頸癌的促進(jìn)作用［32］。

MNX1-AS1 在前列腺癌組織中的表達(dá)相比于癌旁正常組織存在顯著差異（MNX1-AS1在前列腺癌中異常高表達(dá)），MNX1-AS1 高表達(dá)組患者的整體生存情況更差。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，MNX1-AS1被敲減后DU145 與PC3 細(xì)胞的增殖和侵襲遷移顯著增強(qiáng)。針對(duì)MNX1-AS1 的促癌機(jī)制進(jìn)一步研究證實(shí)，過(guò)表達(dá)的MNX1-AS1不僅可以誘導(dǎo)PCNA 表達(dá)上調(diào)進(jìn)而提高前列腺癌細(xì)胞的增殖能力，還能上調(diào)EMT 相關(guān)蛋白Snail 和N-cadherin 的表達(dá)來(lái)加速腫瘤的侵襲和遷移［33］。

已有的研究顯示，膀胱癌細(xì)胞5637 中MNX1-AS1呈異常高表達(dá)；轉(zhuǎn)染sh-MNX1-AS1的腫瘤細(xì)胞A值更低，向劃痕中心的遷移速度減緩，且進(jìn)入G2期的細(xì)胞比例降低；抑制MNX1-AS1 表達(dá)的移植瘤在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)速度減慢。隨后的機(jī)制研究證實(shí)，miR-218-5p與MNX1-AS1及RAB1A之間存在相同的靶向結(jié)合位點(diǎn)，敲減RAB1A能夠抑制5637 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移；過(guò)表達(dá)miR-218-5p或沉默RAB1A都可部分逆轉(zhuǎn)上調(diào)MNX1-AS1 所致的促癌作用。此外，異常高表達(dá)的MNX1-AS1 還可以促進(jìn)EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而提高膀胱癌的遷移和侵襲能力［34］。

3 總結(jié)與展望

得益于基因測(cè)序等技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的lncRNA 被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)lncRNA 在腫瘤中的異常表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制也被不斷揭示。lncRNA MNX1-AS1在諸多腫瘤中異常高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤病理生理學(xué)特征及患者的整體生存情況密切相關(guān)。已有的研究結(jié)果顯示，MNX1-AS1 可以通過(guò)多種方式調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在結(jié)腸癌、肝癌和膀胱癌中作為miR-218-5p 的“分子海綿”調(diào)控下游促癌靶基因；在胃癌、乳腺癌和前列腺癌中促進(jìn)EMT；調(diào)節(jié)胃癌、食管鱗癌和卵巢癌的細(xì)胞周期；激活結(jié)腸癌、乳腺癌和宮頸癌的 STAT3、AKT/mTOR 及 MAPK 信號(hào)通路，然而相關(guān)的上游分子機(jī)制目前還沒有報(bào)道。此外，MNX1-AS1 作為MNX1 的天然反義轉(zhuǎn)錄本是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)MNX1 的轉(zhuǎn)錄、招募相關(guān)蛋白引起組蛋白甲基化以及其他可能的方式來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還需要進(jìn)一步探索。