蔣春飛，劉東文，鄭芳昊

廣東省佛山市中醫(yī)院(佛山 528000)

傷科黃水由黃連、黃柏等共六味中藥組成，是佛山市中醫(yī)院自發(fā)研制的院內(nèi)制劑，主要用于治療跌打損傷、軟組織及骨骼損傷等[1-5]。根據(jù)臨床觀察，傷科黃水的藥物療效確切，安全性較高，具備新藥開(kāi)發(fā)的價(jià)值。目前，按照中藥新藥申報(bào)的要求已經(jīng)完成了臨床前制劑工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和藥效學(xué)的研究工作，但是有關(guān)該制劑的毒副作用卻并不明確[6-13]。考慮到傷科黃水為外用制劑，如果采用外敷的方式進(jìn)行試驗(yàn)，不容易充分暴露潛在的毒性。因此，本研究采用口服給藥的方式考察了傷科黃水重復(fù)給藥的毒副作用。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)藥物：傷科黃水制劑(批號(hào)：17002，佛山市中醫(yī)院自制)，500 ml/瓶，醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)：粵ZB20111358。制備方法：按傷科黃水復(fù)方比例稱取黃連、黃柏、梔子藥材，加水煎煮1.5 h，過(guò)濾，收集濾液；藥渣加入白礬、紫草藥材，再煎煮45 min，加薄荷煮沸15 min，過(guò)濾，收集濾液；合并兩次濾液，濃縮至規(guī)定濃度，加入防腐劑，即得。給藥劑量參考小鼠急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果設(shè)計(jì)。經(jīng)計(jì)算傷科黃水的LD50為51.66 g/kg，28.33 g/kg及以下劑量均未見(jiàn)動(dòng)物死亡。結(jié)合LD50設(shè)置1/2的LD50，即25.83 g/kg為本次試驗(yàn)的最高劑量，按體表面積折算為大鼠的等效劑量為18.33 g/kg，低、中劑量分別設(shè)置為高劑量的1/4、1/2。據(jù)此，試驗(yàn)用藥配制方法為：將傷科黃水原藥液濃縮10倍，分別配置成含原藥材0.46 g/ml、0.92 g/ml、1.83 g/ml的藥液，供動(dòng)物試驗(yàn)用。

1.2 動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠32只，體質(zhì)量180～300 g，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。

1.3 試劑：0.9%氯化鈉注射液(批號(hào)：B17061502，湖南科倫制藥有限公司)；烏來(lái)糖(批號(hào)：20170105654，上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)；尿質(zhì)控液(批號(hào)：55170031，桂林優(yōu)利特集團(tuán)有限公司)；尿液試紙條(批號(hào)：56170949，桂林優(yōu)利特集團(tuán)有限公司)。

1.4 儀器：凈化工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；尿液分析儀(Uritest-200B，桂林優(yōu)利特集團(tuán)有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法 將SD大鼠按體重和性別隨機(jī)均衡分為4組，分別為空白對(duì)照組，傷科黃水4.58 g/kg劑量組、9.16 g/kg劑量組、18.33 g/kg劑量組，每組8只，雌雄各半。試驗(yàn)各組均以10 ml/kg灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d。試驗(yàn)期間，每天觀察大鼠的外觀體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、呼吸、糞便性狀等，在給藥第1、4、7、11、14天測(cè)定大鼠體重。在剖檢前一天(給藥第14天)進(jìn)行尿液、眼科檢查。剖檢當(dāng)天處死全部大鼠，進(jìn)行臟器檢查。

2.1 一般狀況觀察：給藥每天觀察動(dòng)物外觀體征、行為活動(dòng)、分泌物、呼吸、排泄物、中毒反應(yīng)和死亡情況等。每天至少觀察1次，及時(shí)做好記錄，發(fā)現(xiàn)死亡或?yàn)l死動(dòng)物，及時(shí)解剖檢查并盡量采血檢查。每周測(cè)定兩次體重。

2.2 眼科檢查：采用左右眼相互對(duì)比方法，進(jìn)行動(dòng)物雙眼的外觀檢查。用棉簽輕觸眼旁皮膚觀察雙瞼閉合、眼球轉(zhuǎn)動(dòng)等活動(dòng)情況；用光束照射眼睛觀察瞳孔對(duì)光反應(yīng)是否正常；觀察角膜的透明度是否清晰；觀察結(jié)膜的顏色、血管、分泌物有否異常；觀察虹膜的形狀與平整度是否正常。

2.3 尿液檢查：通過(guò)擠壓法采集大鼠尿液，應(yīng)不少于0.5 ml。進(jìn)行尿液外觀檢查后，用尿液分析儀進(jìn)行檢測(cè)。樣本應(yīng)該及時(shí)檢測(cè)，如未能在樣本采集后馬上檢測(cè)，應(yīng)將樣本放在2℃～8℃環(huán)境，并在8 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)環(huán)境溫度應(yīng)控制在15℃～30℃。

2.4 臟器檢查：剖檢當(dāng)天用20%烏來(lái)糖以0.75 ml/100g進(jìn)行皮下注射麻醉，在大鼠麻醉狀態(tài)達(dá)外科麻醉期后，采用腹主動(dòng)脈采血處死。系統(tǒng)剖檢后，肉眼觀察各器官和組織的變化，測(cè)定臟器重量，并采用10%中性福爾馬林固定。臟體系數(shù)、臟腦系數(shù)按如下公式計(jì)算：

結(jié) 果

1 一般狀況觀察 給藥第6、7天，傷科黃水18.33 g/kg劑量組雄性動(dòng)物分別有3例、2例動(dòng)物于給藥前排軟便；給藥第11天，雄性動(dòng)物有1例動(dòng)物出現(xiàn)稀便，1例動(dòng)物出現(xiàn)水樣便，其余各組無(wú)明顯變化。與空白對(duì)照組相比，傷科黃水18.33 g/kg劑量組給藥第14天雌性動(dòng)物的體重(P<0.05)和14 d內(nèi)的增重(P<0.01)均明顯下降，其余各組無(wú)明顯變化。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)表1。

2 眼科檢查 各組動(dòng)物眼科檢查均未見(jiàn)異常。

3 尿液檢查

3.1 雌性動(dòng)物：傷科黃水9.16 g/kg劑量組、18.33 g/kg劑量組分別有2例、4例動(dòng)物尿液外觀呈暗綠色。空白對(duì)照組有2例動(dòng)物尿液隱血(+)，4例動(dòng)物出現(xiàn)蛋白質(zhì)(+)。傷科黃水4.58 g/kg劑量組有3例動(dòng)物尿液出現(xiàn)蛋白質(zhì)(+)。傷科黃水9.16 g/kg劑量組有2例動(dòng)物尿液出現(xiàn)蛋白質(zhì)(+)，1例動(dòng)物蛋白質(zhì)()，1例動(dòng)物出現(xiàn)膽紅素(+)，1例動(dòng)物出現(xiàn)尿膽原(+)，1例動(dòng)物尿膽原(+)。傷科黃水18.33 g/kg劑量組有4例動(dòng)物尿液出現(xiàn)蛋白質(zhì)(+)，3例動(dòng)物出現(xiàn)膽紅素(+)，4例動(dòng)物出現(xiàn)尿膽原(+)，1例動(dòng)物出現(xiàn)白細(xì)胞(+)。

3.2 雄性動(dòng)物：傷科黃水4.58 g/kg劑量組、9.16 g/kg劑量組、18.33 g/kg劑量組分別有1例、1例、4例動(dòng)物尿液外觀呈暗綠色。給藥各劑量組尿比重高于空白對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，尿液pH低于陰性對(duì)照組(P<0.01)?？瞻讓?duì)照組有1例動(dòng)物尿液出現(xiàn)蛋白質(zhì)(+)，3例動(dòng)物蛋白質(zhì)(+)，4例動(dòng)物出現(xiàn)酮體(+)。傷科黃水4.58 g/kg劑量組有1例動(dòng)物尿液出現(xiàn)隱血(+)，1例動(dòng)物隱血()，1例動(dòng)物隱血()，1例動(dòng)物尿液出現(xiàn)蛋白質(zhì)(+)，2例動(dòng)物蛋白質(zhì)(+)，1例動(dòng)物蛋白質(zhì)()。傷科黃水9.16 g/kg劑量組有1例動(dòng)物尿液出現(xiàn)蛋白質(zhì)(+)，3例動(dòng)物蛋白質(zhì)()，1例動(dòng)物出現(xiàn)酮體(+)，1例動(dòng)物酮體(+)。傷科黃水18.33 g/kg劑量組有1例動(dòng)物尿液出現(xiàn)隱血(+)，2例動(dòng)物蛋白質(zhì)(+)，2例動(dòng)物蛋白質(zhì)()，1例動(dòng)物出現(xiàn)尿膽原(+)。

表1 傷科黃水連續(xù)給藥對(duì)SD大鼠體重的影響

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，△P<0.01

表2 傷科黃水連續(xù)給藥對(duì)SD大鼠尿常規(guī)的影響(n=4)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，△P<0.01

4 臟器檢查

4.1 雌性動(dòng)物：受試各組動(dòng)物未見(jiàn)明顯臟器損傷。傷科黃水18.33 g/kg劑量組胸腺臟器重量、臟體系數(shù)、臟腦系數(shù)低于空白對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，心臟臟器重量低于空白對(duì)照組(P<0.05)，其余各組無(wú)明顯差異。

4.2 雄性動(dòng)物：受試各組動(dòng)物未見(jiàn)明顯臟器損傷。傷科黃水9.16 g/kg劑量組睪丸臟腦系數(shù)低于空白對(duì)照組，其余各組未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表3 傷科黃水連續(xù)給藥對(duì)SD大鼠臟器重量的影響

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，△P<0.01

表4 傷科黃水連續(xù)給藥14 d對(duì)SD大鼠臟體系數(shù)的影響

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，△P<0.01

表5 傷科黃水連續(xù)給藥14 d對(duì)SD大鼠臟腦系數(shù)的影響

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，△P<0.01

討 論

傷科黃水作為院內(nèi)制劑在佛山市中醫(yī)院已有60多年的使用歷史，臨床療效確切，未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用。該制劑于2015年獲得廣東省中醫(yī)藥局中醫(yī)藥強(qiáng)省專項(xiàng)資金-醫(yī)院中藥制劑開(kāi)發(fā)項(xiàng)目的資助，計(jì)劃通過(guò)3年的組織實(shí)施，深度改良制劑處方和制備工藝，提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，明確藥理藥效，使之成為安全性高、臨床療效確切、質(zhì)量穩(wěn)定可控、使用方便的中藥制劑，并爭(zhēng)取培育成擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中藥新藥。本研究正是在處方固定、生產(chǎn)工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可控的前提下，根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)中藥新藥注冊(cè)申報(bào)的要求，進(jìn)行了長(zhǎng)期毒性的初步研究。

有研究表明，黃連單味水煎液灌胃給小鼠后，會(huì)出現(xiàn)活動(dòng)減少、呼吸急促、被毛粗亂的現(xiàn)象，部分小鼠甚至出現(xiàn)痙攣、死亡的情況，剖檢結(jié)果表明主要毒性靶器官為腦、肝、脾、肺、腎[4]。黃連、黃柏作為苦寒類中藥的代表，容易引起引起稀便甚至腹瀉[14-15]。本研究表明，傷科黃水經(jīng)口給藥后，部分大鼠雖出現(xiàn)了軟便或稀便現(xiàn)象，與黃連、黃柏誘導(dǎo)的胃腸道刺激反應(yīng)一致，但是對(duì)主要功能器官并未產(chǎn)生毒性作用。而傷科黃水作為外用制劑，通常透皮吸收后進(jìn)入胃腸道的可能較小，不會(huì)引起胃腸道反應(yīng)。另外，不同劑量的傷科黃水對(duì)大鼠尿液產(chǎn)生了一定影響，但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)主要與藥物濃度有關(guān)，并未產(chǎn)生病理性代謝產(chǎn)物。因此，可以認(rèn)為傷科黃水未有明顯的毒副作用。

本研究觀察了連續(xù)灌胃給予傷科黃水后大鼠產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，主要的毒性靶器官或靶組織及其損害的可逆性，為臨床主要監(jiān)測(cè)指標(biāo)提供一定參考。