張增帥，董文賓, ，盧軍，許先猛，黃健, ，馬蓉麗

1. 運城職業(yè)技術(shù)學(xué)院（運城 044000）；2. 陜西科技大學(xué)（西安 710021）；3. 漢中市食品藥品監(jiān)督管理局（漢中 723000）；4. 運城學(xué)院（運城 044000）

桑椹（Mulberry），俗稱桑果，含有維生素、氨基酸、礦物質(zhì)、酚類、總黃酮等活性成分[1]，具有抑制有害物質(zhì)的生成、利肝、利尿、治療痢疾、延緩細(xì)胞衰老、增強免疫力、清除自由基等功效[2-3]。2017年國家衛(wèi)計委最新發(fā)布數(shù)據(jù)顯示，桑葚是“藥食同源”食品之一。桑葚通體呈現(xiàn)黑紫色或紫紅色，紅色素含量較豐富，色價高。近年來，合成色素安全性問題嚴(yán)重阻礙了食用色素的發(fā)展，天然色素的開發(fā)和研究已成為部分研究學(xué)者的關(guān)注重點[4]。桑椹紅色素具有安全性高、著色效果好等優(yōu)勢，被列入食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，且作為功能性著色劑在果酒、果汁、飲料、糖果中廣泛應(yīng)用。

桑椹色素屬花色苷類色素，主要著色成分為矢車菊-3-葡萄糖苷[2]，桑葚色素具有清除自由基、抗氧化等功效[5]。近些年桑葚色素提取方法研究廣泛，溶劑萃取法[6]、大孔樹脂吸附法[7]、超聲波輔助提取法[8]等研究和應(yīng)用較為成熟，但國內(nèi)外鮮有桑葚色素純化的研究報道。試驗綜合考慮色素純化經(jīng)濟性、安全性和可放大性，采用雙水相萃取法輔以超聲波作用，純化桑葚色素，并對色素的抗氧化性進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑椹，市售。

丙酮、甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、檸檬酸、醋酸、醋酸鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、濃鹽酸、氯化鉀、1, 1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）、3, 5-二硝基水楊酸、2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、沒食子酸丙酯（PG）、抗壞血酸以及其它化學(xué)試劑，均為分析純。

BS-224型電子天平，德國SARTORIUS公司；TDL-5型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-III循環(huán)水多用真空泵，上海亞榮生化儀器廠；KQ-250 TDV高頻數(shù)控超聲清洗機，昆山市超聲儀器有公司；722型可見分光光度計，752型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；TDL-5型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；JB 2-14型磁力攪拌器，上海大普儀器有限公司；PHS-3 C精密pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-Z 2恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52 AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；101-1 AB電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 桑葚色素提取工藝及桑葚色素萃取制備

桑葚色素提取工藝：取適量桑椹→制漿→準(zhǔn)確稱取→加入80%酸性乙醇溶液（pH 2.0），攪拌均勻→50℃水浴提取2 h→取上清液，濃縮→醇沉→過濾→濃縮→制得桑葚色素溶液（冷藏備用）。

桑葚色素萃取制備：桑葚色素溶液→超聲波輔助雙水相萃取→濃縮→冷凍干燥。

1.2.2 桑葚色素測定方法

pH示差測定法[9]：分別取1 mL桑葚色素溶液樣品置于兩根試管之中，分別加入pH 1.0±0.01的緩沖溶液與pH 4.5的緩沖溶液，靜置后得到待測液。平行測定3組，按式（1）和（2）計算桑葚色素濃度。

式中：ε表示矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；DF表示稀釋因子；MW表示矢車菊花素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2；L表示光程，1 cm。以蒸餾水作為參比，用A700nm來消除樣液混濁的影響。

1.2.3 桑葚色素回收率測定

稱取適量硫酸銨于離心管中，加水溶解，然后加入適量無水乙醇，最后加入桑葚色素溶液樣品，固定體系質(zhì)量20 g。超聲處理后在3 500 r/min條件下離心10 min。記錄上下相體積，并測定上下相中色素含量。桑葚色素回收率（Y）按式（3）計算。

式中：VT，VB分別表示上下相體積，mL；CT，CB分別表示上下相桑葚色素的質(zhì)量濃度，mg/L。

1.2.4 雙水相體系的選擇

分別選擇有機相甲醇、乙醇，鹽相硫酸銨、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀。在離心管中加入等質(zhì)量的鹽相，加水溶解，再加入有機相，觀察各自分相狀況，并測定不同體系的pH。

1.2.5 桑葚色素萃取條件的單因素試驗考察

選取鹽濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶液pH、超聲功率、超聲時間、萃取溫度、料液比等單因素進行試驗，考察各因素對桑葚色素萃取回收率的影響。

1.2.6 桑葚色素萃取條件的正交試驗考察

根據(jù)單因素試驗，選取硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和超聲時間4個因素進行正交試驗，選取3個水平，采用L9(34)設(shè)計正交試驗進行條件優(yōu)化。試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平

1.2.7 桑葚色素抗氧化性研究

1.2.7.1 清除1, 1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）能力的測定

取質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的桑葚色素、BHT、PG、VC溶液，按照許先猛等[10]方法分別測定其對DPPH·清除率，每個樣品重復(fù)做3次。

1.2.7.2 清除羥自由基（·OH）能力的測定

取質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的桑葚色素、BHT、PG、VC溶液，測定方法參考劉繼攀等[11]的報道，稍作改動?？瞻坠転?.0 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液和8.0 mL蒸餾水，未損傷管為2.0 mL的磷酸緩沖液、1.0 mL 7.5 mmol/L FeSO4、1.5 mL 5.0 mmol/L鄰二氮菲和5.5 mL蒸餾水。損傷管為2.0 mL的磷酸緩沖液、1.0 mL FeSO4、1.5 mL的鄰二氮菲、1.0 mL H2O2（0.1%）和4.5 mL蒸餾水。樣品管為2.0 mL的磷酸緩沖液、1.0 mL FeSO4、1.5 mL鄰二氮菲、1.0 mL樣品液、1.0 mL H2O2和3.5 mL蒸餾水。置于恒溫水浴鍋中，于37 ℃保溫60 min，在波長510 nm處測吸光度（A）。按式（4）計算羥自由基（·OH）清除率。

1.2.7.3 清除超氧陰離子（O2-·）能力的測定

取樣質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的桑葚色素、BHT、PG、VC溶液，測定方法參考胡月芳[12]的報道，稍作改動。取4.5 mL的Tris-HCl緩沖液（pH 8.20，50 mmol/L）于試管中，將試管置于恒溫水浴鍋中，于25 ℃保溫20 min，取出，加入40 μL 25 ℃的鄰苯三酚溶液（45 mmol/L，溶劑為10 mmol/L HCl），混勻，在波長420 nm處測定吸光度（A），每隔30 s測定1次。按式（5）計算超氧陰離子（O2-·）清除率。

式中：A0表示鄰苯三酚的自氧化速率；A1表示加入樣品后的自氧化速率。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相體系的確定

研究結(jié)果表明，乙醇與磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸銨均能形成雙水相。乙醇與硫酸銨形成的雙水相體系穩(wěn)定，界面明顯，其他雙水相體系效果不理想。研究表明[13]，桑椹色素在偏酸性條件下特別是在鹽酸溶液中穩(wěn)定性較好。為保證桑葚色素化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和桑葚色素的萃取效果，將乙醇-硫酸銨雙水相體系用鹽酸調(diào)節(jié)pH 4.0左右。

2.2 單因素試驗結(jié)果

單因素試驗主要考察了硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶液pH、超聲功率、超聲時間、萃取溫度、料液比對桑葚色素回收率的影響。

在乙醇體積分?jǐn)?shù)25%、溶液pH 4.0、超聲功率200 W、超聲時間20 min、萃取溫度40 ℃、料液比1︰10 g/mL條件下，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對桑葚色素回收率的影響如圖1（a）所示。在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%～22%范圍內(nèi)，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，桑葚色素回收率呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過22%時，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，桑葚色素回收率呈現(xiàn)平穩(wěn)且略有上升的趨勢。這是由于硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)會影響雙水相分配系數(shù)和體積比，從而導(dǎo)致雙水相的兩相體積發(fā)生較大變化，影響結(jié)果[14]。硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)變大，上相中部分水會分配到下相中，從而使部分色素進入下相，造成桑葚色素?fù)p失。

在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%、溶液pH 4.0、超聲功率200 W、超聲時間20 min、萃取溫度40 ℃、料液比1︰10 g/mL條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)對桑葚色素回收率的影響如圖1（b）所示。在乙醇體積分?jǐn)?shù)15%～35%范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，桑葚色素回收率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這是由于雙水相體系中，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，下相中的水會向上相轉(zhuǎn)移，上相體積增大，因此上相中桑葚色素含量增加[15]。但是乙醇體積分?jǐn)?shù)過大會導(dǎo)致下相中有硫酸銨析出，從而影響雙水相體系，不利于桑葚色素的分配，降低桑葚色素回收率。

在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%、乙醇體積分?jǐn)?shù)25%、超聲功率200 W、超聲時間20 min、萃取溫度40 ℃、料液比1︰10 g/mL條件下。溶液pH對桑葚色素回收率的影響如圖1（c）所示。在溶液pH在2～6范圍內(nèi)，隨著溶液pH的增大，桑葚色素回收率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。桑葚色素在酸性環(huán)境中比較穩(wěn)定，當(dāng)液pH不斷增大，部分桑葚色素結(jié)構(gòu)會被破壞，從而降低桑葚色素回收率[13]。

在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%、乙醇體積分?jǐn)?shù)25%、溶液pH 4.0、超聲時間20 min、萃取溫度40 ℃、料液比1︰10 g/mL條件下，超聲功率對桑葚色素回收率的影響如圖1（d）所示。在超聲功率100～500 W范圍內(nèi)，隨著超聲功率的增大，桑葚色素回收率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這是由于超聲波通過空化作用、機械作用和熱效應(yīng)加速雙水相充分分離，提萃取效率[15]。當(dāng)超聲波功率過大時，超聲波空化作用過于劇烈會增加雙水相中空氣，不利于色素在雙水相中的分配，從而降低桑葚色素回收率。

在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%、乙醇體積分?jǐn)?shù)25%、溶液pH 4.0、超聲功率200 W、萃取溫度40 ℃、料液比1︰10 g/mL條件下，超聲時間對桑葚色素回收率的影響如圖1（e）所示。在超聲時間10～50 min范圍內(nèi)，隨著超聲時間的延長，桑葚色素回收率呈現(xiàn)先上升后趨于平行的趨勢。這是由于適宜功率的超聲波加速雙水相充分分離，提高桑葚色素回收率。

在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%、乙醇體積分?jǐn)?shù)25%、溶液pH 4.0、超聲功率200 W、超聲時間20 min、料液比1︰10 g/mL條件下，萃取溫度對桑葚色素回收率的影響如圖1（f）所示。在萃取溫度30～70 ℃范圍內(nèi)，隨著萃取溫度的升高，桑葚色素回收率呈現(xiàn)先緩慢上升后緩慢下降的趨勢。升高雙水相體系溫度可以加快分子擴散運動，加速雙水相體系充分分離，提高桑葚色素回收率。當(dāng)溫度過高時，部分熱敏性色素的結(jié)構(gòu)遭到破壞，這降低了桑葚色素的回收率。

在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%、乙醇體積分?jǐn)?shù)25%、溶液pH 4.0、超聲功率200 W、超聲時間20 min、萃取溫度40 ℃條件下，料液比對桑葚色素回收率的影響如圖1（g）所示。在料液比1︰5～1︰25 g/mL范圍內(nèi)，料液比的變化對萃取效果影響不大。

2.3 正交試驗結(jié)果

按L9(34)進行正交試驗，結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，影響桑葚色素回收率的因素大小依次為RB＞RC＞RA＞RD，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲功率＞硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞超聲時間，超聲波輔助雙水相萃取桑葚色素最佳工藝為A1B2C3D2，即硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%，乙醇體積分?jǐn)?shù)為25%，超聲功率為300 W，超聲時間為30 min。按此條件進行驗證試驗，桑葚色素回收率為80.5%。

2.4 桑葚色素抗氧化性研究

2.4.1 不同樣品對1, 1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）清除能力的測定

將不同樣品配制成相同濃度（0.10 mg/mL），測定其DPPH·清除能力，結(jié)果如圖2所示。4種樣品對DPPH·均有清除效果，VC對DPPH·的清除效果最好，桑葚色素次之，PG與BHT對DPPH·清除率較低。于哲[17]研究表明，桑葚色素對DPPH·具有一定的清除率，有較好的抗氧化活性，這與此次試驗結(jié)果一致。

2.4.2 不同樣品對羥自由基（·OH）清除能力的測定

將不同樣品配制成相同濃度（0.10 mg/mL），測定其羥自由基的清除能力，結(jié)果如圖3所示。4種物質(zhì)對·OH均有清除效果，桑葚色素對·OH的清除效果最好，PG次之，VC和BHT對·OH清除率較低。

圖1 各因素對桑葚色素回收率影響

表2 正交試驗表

圖2 對DPPH·的清除效果

圖3 對羥自由基的清除效果

將不同樣品配制成相同的濃度（0.10 mg/mL），測定其清除超氧陰離子的能力，結(jié)果如圖4所示。4種物質(zhì)對O2-·均有清除效果，桑葚色素對O2-·的清除效果最好，BHT次之，PG和VC對O2-·清除率較低。牛天羽等[18]研究表明，當(dāng)桑葚色素（花色苷）質(zhì)量濃度為0.1～2.0 mg/mL時，其對O2-·清除率為10%～70%，這與此次試驗結(jié)果基本一致。

圖4 對超氧陰離子的清除效果

3 結(jié)論

選用乙醇-硫酸銨雙水相體系，pH控制在4.0左右提取桑葚色素，桑葚色素化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且桑葚色素萃取效果較好。通過正交試驗得出超聲波輔助雙水相萃取桑葚色素最佳工藝為：硫酸鈉濃度16%，乙醇體積分?jǐn)?shù)25%，超聲功率300 W，超聲時間30 min。按此條件進行驗證試驗，桑葚色素回收率為80.5%。桑葚色素抗氧化結(jié)果表明，桑葚色素對1, 1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）、羥自由基（·OH）和超氧陰離子（）均有較好的清除作用，與同濃度的BHT、PG和VC三種試劑相比，桑葚色素具有較強的抗氧化活性。