楊欣宜，郭輝*，陳云菲，錢俊青，莊勇

1(浙江工業(yè)大學(xué)，浙江 杭州，310000)2(南通市常海食品添加劑有限公司，江蘇 南通，226000)

三氯蔗糖是一種甜度高、無熱量的甜味劑[1]，它不被人體吸收，可供肥胖、糖尿病患者食用，是一種保健型的優(yōu)質(zhì)調(diào)味劑[2]。三氯蔗糖的制備過程較為復(fù)雜，包括合成蔗糖-6-乙酯，氯化和脫乙?；痆3]。其中蔗糖-6-乙酯是單基團保護法制備三氯蔗糖的重要中間體[4]。由于蔗糖-6-乙酯衍生物很多，同時這類成分基本沒有紫外吸收，如何對其進行定性定量的分析一直是亟需解決的問題。

薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[5-8]是定性定量檢測蔗糖-6-乙酯的常用分析方法。薄層色譜法很早便用于蔗糖酯的分析，并且應(yīng)用廣泛，有文獻報道以V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=3∶2為展開劑成功監(jiān)測了蔗糖-6-乙酯的反應(yīng)進程[9]。喻理德等[10]采用V(丙酮)∶V(乙酸乙酯)∶V(冰醋酸)∶V(DMF)=4∶5∶0.5∶0.5)作展開劑，50 %的甲醇硫酸液作顯色劑，在115℃下烘干顯色，結(jié)果表示該法能較好地分離6-位及4-位蔗糖乙酸酯。薄層色譜法操作快速簡便，但由于蔗糖酯本身不顯色，需要配制顯色劑，并且合成蔗糖-6-乙酯過程中有較多副產(chǎn)物，薄層色譜法難以將其很好地分離，需要其他的方法有效分離產(chǎn)物[11]。目前，對蔗糖-6-乙酯的檢測以高效液相色譜法為主，用于蔗糖-6-乙酯的合成分析的檢測器有示差折光檢測器(refractive index detector,RID)和蒸發(fā)光散射檢測器(evaporative light scattering detector,ELSD)。李明華等[12]利用高效液相色譜法檢測在離子介質(zhì)中反應(yīng)的蔗糖-6-乙酯，采用示差檢測器，以C18(250 mm×4.6 mm×5 μm為色譜柱，V(甲醇)∶V(水)=70∶30為流動相，定量檢測了蔗糖-6-乙酯含量。陸正清等[13]制備了蔗糖-6-乙酯并用高效液相色譜進行檢測，采用C18反相色譜柱，V(乙腈)∶V(水)=15∶85作流動相，準(zhǔn)確測定了蔗糖-6-乙酯的含量并由此計算產(chǎn)率。相較于示差折光檢測器，蒸發(fā)光散射檢測器更穩(wěn)定，靈敏度更高，不需要復(fù)雜的樣品制備，且可梯度洗脫。目前采用蒸發(fā)光散射檢測器分析蔗糖-6-乙酯的文獻較少，無分析方法研究文獻。為了找到方便、準(zhǔn)確的測定方法，本試驗采用HPLC-ELSD建立了蔗糖-6-乙酯含量的測定方法，并對外標(biāo)法與內(nèi)標(biāo)法進行了比較。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

固定化疏棉狀噬熱絲孢菌脂肪酶(TLIM酶)，250 IUN/g，諾維信生物技術(shù)有限公司；蔗糖八乙酸酯(分析純，純度為98 %)，阿拉丁試劑有限公司；蔗糖-6-乙酯(純度>95 %)，實驗室自制[14]；甲醇、乙腈為色譜純，Sigma；蔗糖、乙酸乙烯酯、叔戊醇、二甲基亞砜均為化學(xué)純，國藥集團化試劑有限公司。

Agilent 1200高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測器，美國Grace公司；HH-4水浴恒溫振蕩器，金壇市江南儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備

稱取10.3 g蔗糖(0.3 mol/L)、25.8 g(3 mol/L)乙酸乙烯酯、4 g TLIM酶、1 g 4A分子篩于250 mL具塞三角瓶中，再加入(V(叔戊醇)∶V(二甲基亞砜)=83∶17)溶劑，置于恒溫?fù)u床中，30 ℃、180 r/min的條件下反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液在3 500 r/min的條件下離心10 min，取上清液，進液相分析，每組3個平行。

1.2.2 高效液相色譜條件的選擇

高效液相色譜法是一種較為普遍的分析方法，其分離度好、檢測靈敏度高、方便快捷，通常與紫外檢測器或示差折光檢測聯(lián)用[15]。由于蔗糖與蔗糖酯不含發(fā)色團，因此用紫外檢測器無法檢測分離；示差折光檢測器雖然對糖類的檢測較為靈敏，但其容易受溫度與流動相的影響，并且不適用于梯度洗脫。蒸發(fā)光散射檢測器是近年來使用廣泛的通用型檢測器，其能檢測不含發(fā)色團的化合物，適用于梯度洗脫，并且成本低、操作簡單、不受溫度影響[16]。有文獻報道糖類更適合用ELSD進行檢測，其靈敏度高于示差折光檢測器[17]。通過先前試驗室的研究基礎(chǔ)得知[18]，蔗糖-6-乙酯的檢測采用ELSD，并以水作流動相，可以在20 min內(nèi)將產(chǎn)物和試劑洗脫。

因此本試驗以HPLC-ELSD對蔗糖-6-乙酯進行檢測，依次對色譜柱、流動相、柱溫條件進行選擇，以確定最佳HPLC分析條件。

1.2.3 外標(biāo)法

1.2.3.1 線性考察

精密稱取蔗糖-6-乙酯自制對照品，分別用叔戊醇配制成濃度為1.10、1.84、2.21、2.76、3.64、5.52、8.27、11.03 g/L的蔗糖-6-乙酯樣品溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，依次在選定的色譜條件下進樣(每個樣品重復(fù)測定3次)，考察蔗糖-6-乙酯峰面積及其對應(yīng)的濃度的關(guān)系。

1.2.3.2 精密度考察

取同一份供試品溶液，在所建立的色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算RSD值。

1.2.3.3 重復(fù)性考察

取同一樣品溶液6份，按供試品制備方法進行制備，在所建立的色譜條件下測定，記錄色譜圖，計算RSD值。

1.2.3.4 穩(wěn)定性考察

取同一份供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h在相同色譜條件下進行測定，記錄色譜圖，計算RSD值。

1.2.3.5 檢出限和定量限

LOD定義為S/N=3時對應(yīng)的待分析濃度，LOQ定義為S/N=10 時對應(yīng)的待分析濃度。

制備濃度為0.55 g/L的對照品溶液，并取12份進行測定，分別記錄其響應(yīng)值，如公式(1)、(2)所示：

(1)

(2)

1.2.4 內(nèi)標(biāo)法

色譜條件：檢測器：ELSD；色譜柱：ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)；梯度洗脫流動相：0～8 min,5%甲醇，9～12 min,30%甲醇，13～22 min,75%甲醇；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。蒸發(fā)光檢測器溫度：85 ℃；氮氣流速：1.5 L/min。

樣品溶液制備：稱取0.02 g蔗糖八乙酸酯，用樣品溶液溶解并定容至10 mL。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，再經(jīng)HPLC分析。

1.2.4.1 線性考察

稱取蔗糖-6-乙酯對照品和0.02 g蔗糖八乙酸酯，分別用叔戊醇配制成濃度為1.10、1.84、2.21、2.76、3.64、5.52、8.27、11.03 g/L的對照品溶液。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，依次在選定的色譜條件下進樣(每個樣品重復(fù)測定3次)，考察各樣品的峰面積及其對應(yīng)的濃度的關(guān)系。

1.2.4.2 精密度考察

取同一份制備好的樣品溶液，在所建立的色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算RSD值。

1.2.4.3 重復(fù)性考察

取同一樣品6份，按制備方法進行制備，在所建立的色譜條件下測定，記錄色譜圖，計算RSD值。

1.2.4.4 穩(wěn)定性考察

取同一份樣品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h在相同色譜條件下進行測定，記錄色譜圖，計算RSD值。

1.2.4.5 檢出限和定量限

稱取0.02 g蔗糖八乙酸酯，制備濃度為0.55 g/L的對照品溶液，并取12份進行測定，分別記錄其響應(yīng)值。按式(1)、(2)計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 色譜柱的選擇

選定HPLC條件為：檢測器：ELSD；流動相：V(甲醇)∶V(水)=10∶90；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。蒸發(fā)光檢測器溫度：85℃；氮氣流速：1.5 L/min。分別考察ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)、ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)對分離效果的影響。由圖1可以看到，采用ZORBAX SB-C18、Eclipse XDB-C18、Extend-C18柱的色譜圖中蔗糖多酯峰形矮胖、分離效果不好，而ZORBAX SB-Aq柱不僅對蔗糖、蔗糖-6-乙酯和蔗糖多酯的分離效果都較好，并且保留時間較短，因此選擇ZORBAX SB-Aq進行后續(xù)試驗。

圖1 不同色譜柱下的蔗糖-6-乙酯HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of sucrose-6-acetate under different columns

2.1.2 流動相的選擇

選定HPLC條件為：檢測器：ELSD；色譜柱：ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。蒸發(fā)光檢測器溫度∶85℃；氮氣流速：1.5 L/min。對V(甲醇)∶V(水)=5∶95、V(甲醇)∶V(水)=10∶90、V(甲醇)∶V(水)=15∶85、V(甲醇)∶V(水)=20∶80、V(甲醇)∶V(水)=30∶70六種流動相系統(tǒng)進行考察。由圖2可以看到，隨著流動相極性減小，保留時間變短，但各組分距離變近，分離度變小，分離效果不好。但考慮超純水保留時間較長，最后選擇V(甲醇)∶V(水)=5∶95為流動相，來進行后續(xù)試驗。

圖2 不同流動相下的蔗糖-6-乙酯HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sucrose-6-acetate in different mobile phases

2.1.3 柱溫的選擇

在2.1.2的試驗條件下，分別考察柱溫為：20、25、30、35、40 ℃時對分離效果的影響。如圖3所示，隨著溫度的升高，蔗糖保留時間不變，蔗糖-6-乙酯保留時間變短，蔗糖多酯保留時間變長，同時蔗糖多酯的峰在30 ℃時分離效果較好，因此綜合考慮最終選擇柱溫為30 ℃，進行后續(xù)試驗。

圖3 不同柱溫下的蔗糖-6-乙酯HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of sucrose-6-acetate in different mobile phases

2.1.4 色譜條件的確定

樣品的分離色譜圖如圖4所示。蔗糖保留時間為3.732 min，蔗糖-6-乙酯保留時間為7.143 min，蔗糖多酯保留時間為17.272 min。

圖4 蔗糖-6-乙酯樣品色譜圖Fig.4 Sucrose-6-acetate sample chromatogram

2.3 外標(biāo)法

2.3.1 線性考察

將不同濃度樣品溶液進行HPLC分析，由于蒸發(fā)光散射檢測器響應(yīng)值與濃度關(guān)系較為復(fù)雜，查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)糖類或糖酯類的ELSD分析采用的線性關(guān)系主要有2種：濃度與峰面積直接作線性回歸、濃度的對數(shù)與峰面積的對數(shù)作線性回歸[15, 19-20]。于是對兩種線性關(guān)系進行了比較，結(jié)果如圖5所示。

a-濃度對數(shù)與峰面積對數(shù)線性回歸圖；b-濃度與峰面積線性回歸圖圖5 外標(biāo)法測定蔗糖-6-乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.5 Standard curve of sucrose-6-ethyl by external standard method

結(jié)果表明將濃度與峰面積直接進行線性回歸關(guān)系更加良好。圖5表明，在1.10～11.03 g/L，蔗糖-6-乙酯質(zhì)量濃度與其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=2 427.8C-3 355.4，相關(guān)系數(shù)為R2=0.994。

2.3.2 精密度考察

取同一份樣品溶液，在優(yōu)化的色譜條件下連續(xù)進樣6次，測得6次試驗結(jié)果如表1所示，RSD<3.0 %，表明該方法精密度好。

表1 外標(biāo)法測定蔗糖-6-乙酯精密度結(jié)果Table 1 Determination of the precision of sucrose-6-acetate by external standard method

2.3.3 重復(fù)性考察

取同一樣品6份，按供試品制備方法進行制備，在所建立的色譜條件下測定，測得試驗結(jié)果如表2所示，RSD<2.0 %，表明該方法重現(xiàn)性良好。

表2 外標(biāo)法測定蔗糖-6-乙酯重復(fù)性結(jié)果Table 2 Determination of the repeatability of sucrose-6-acetate by external standard method

2.3.4 穩(wěn)定性考察

取同一份供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h在相同色譜條件下進行測定，對含量的變化情況進行計算分析，結(jié)果如表3所示。由表可知，其RSD<2.0 %，說明在24 h內(nèi)該檢測方法穩(wěn)定可靠。

表3 外標(biāo)法測定蔗糖-6-乙酯穩(wěn)定性結(jié)果Table 3 Determination of the stability of sucrose-6-acetateby external standard method

2.3.5 檢出限和定量限

將12份濃度為0.55 g/L的樣品進行測定，記錄峰面積，計算得到LOD=53.05 μg/mL，LOQ=176.83 μg/mL。

2.4 內(nèi)標(biāo)法

樣品與內(nèi)標(biāo)的分離色譜圖如圖所示。蔗糖保留時間為3.796 min，蔗糖-6-乙酯保留時間為6.856 min，蔗糖多酯保留時間為10.630 min，蔗糖八乙酸酯保留時間為17.813 min。

圖6 內(nèi)標(biāo)法測定蔗糖-6-乙酯樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of sucrose-6-acetate sample by internal standard method

2.4.1 線性考察

將不同濃度樣品溶液進行HPLC分析，分別作了濃度與峰面積的線性回歸和濃度對數(shù)與峰面積對數(shù)的線性回歸(圖7)。

a-濃度對數(shù)與峰面積對數(shù)線性回歸圖；b-濃度與峰面積線性回歸圖圖7 內(nèi)標(biāo)法測定蔗糖-6-乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.7 Standard curve of sucrose-6-ethyl by internal standard method

經(jīng)過比較濃度與峰面積的線性關(guān)系和濃度的對數(shù)與峰面積的對數(shù)的線性關(guān)系，結(jié)果表明，將濃度與峰面積直接進行線性回歸關(guān)系更加良好。在1.10～11.03 g/L，蔗糖-6-乙酯質(zhì)量濃度與其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=1 197.5C-525.75，相關(guān)系數(shù)為R2=0.996 1。

2.4.2 精密度考察

取同一份樣品溶液，在內(nèi)標(biāo)法色譜條件下連續(xù)進樣6次，測得6次試驗結(jié)果如表4所示，RSD<1.0 %，表明該內(nèi)標(biāo)法精密度很好。

表4 內(nèi)標(biāo)法測定蔗糖-6-乙酯精密度結(jié)果Table 4 Determination of the precision of sucrose-6-acetateby internal standard method

2.4.3 重復(fù)性考察

取同一樣品溶液6份，按制備方法進行制備，在內(nèi)標(biāo)法色譜條件下測定，測得試驗結(jié)果如表5所示，RSD 1.0 %，表明該方法重復(fù)性良好。

表5 內(nèi)標(biāo)法測定蔗糖-6-乙酯重復(fù)性結(jié)果Table 5 Determination of the repeatability of sucrose-6-acetate by internal standard method

2.4.4 穩(wěn)定性考察

取同一份樣品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h在相同色譜條件下進行測定，對樣品含量的變化情況進行計算分析，結(jié)果如表6所示。RSD<2.0 %，說明在24 h內(nèi)該檢測方法穩(wěn)定可靠。

表6 內(nèi)標(biāo)法測定蔗糖-6-乙酯穩(wěn)定性結(jié)果Table 6 Determination of the stability of sucrose-6-acetateby internal standard method

2.4.5 檢出限和定量限

將12份質(zhì)量濃度為0.55 g/L的對照品任溶液進行測定，記錄峰面積，計算得到LOD=31.04 μg/mL，LOQ=103.46 μg/mL。

3 結(jié)論

本文對蔗糖-6-乙酯的檢測分析方法進行了條件優(yōu)化，建立了能夠快速準(zhǔn)確測定蔗糖-6-乙酯的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測方法(HPLC-ELSD)。首次對檢測蔗糖-6-乙酯所建立的分析方法進行了方法學(xué)驗證，得到較好的結(jié)果。同時通過HPLC-ELSD進行內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法檢測，并對兩種方法進行比較，結(jié)果表明2種方法各項指標(biāo)都能滿足試驗室要求。其中外標(biāo)法無需前處理，可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線直接計算含量，更簡便快速；相比較而言，內(nèi)標(biāo)法可以一定程度上抵消大多外界條件的影響，因而更準(zhǔn)確，而且內(nèi)標(biāo)法可以在無標(biāo)準(zhǔn)品情況下進行檢測，優(yōu)越性更高。因此可以根據(jù)試驗室條件與需求對兩種方法進行選擇。與現(xiàn)有的檢測蔗糖-6-乙酯的分析方法相比，本文所建立的分析方法穩(wěn)定、快捷、方便、準(zhǔn)確，并且所做的方法學(xué)驗證確保了該分析方法的可靠性，為蔗糖酯的檢測分析提供了參考。