陳志娜，裴紀(jì)柳，葉韜,2，薛詠振，詹志強(qiáng)，李雅，劉天

1 (淮南師范學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 淮南，232038) 2 (資源與環(huán)境生物技術(shù)安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮南，232038)

屎腸球菌(Enterococcusfaecium)是革蘭氏陽(yáng)性球菌，屬腸球菌屬，菌落形態(tài)呈卵圓形，在其培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸，是一種兼性厭氧的乳酸菌，廣泛分布于人體和動(dòng)物腸道中，是腸道中的正常菌群[1]，具有耐酸、耐熱、腸道黏附能力強(qiáng)等特點(diǎn)，還具有抑制病原菌、增強(qiáng)免疫力等作用[2]。相對(duì)于需要嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)、保存條件極為苛刻的雙歧桿菌和乳桿菌來(lái)說(shuō)，屎腸球菌的生長(zhǎng)特性決定其是便于工業(yè)化生產(chǎn)和畜牧業(yè)使用的首選菌種之一[3]。屎腸球菌廣泛存在于傳統(tǒng)乳制品[3-5]、泡菜[6]、豆醬[7]、香腸[8]等發(fā)酵食品中，可以影響食品的香氣、風(fēng)味、質(zhì)地，還能產(chǎn)生多種有益成分[9]。但是腸球菌屬是臨床上一種條件致病菌，可引起呼吸道、泌尿生殖道、腹腔等部位的感染[10-11]。引起感染的主要原因是因?yàn)槟c球菌屬含有毒力因子和比較廣泛的耐藥性[12]。多重耐藥菌株往往導(dǎo)致嚴(yán)重的感染，不能很好地治愈，特別是萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌在公共衛(wèi)生方面產(chǎn)生的問(wèn)題[13]。因此，屎腸球菌在應(yīng)用之前必須要對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。

實(shí)驗(yàn)室前期從發(fā)酵泡菜中篩選出1株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的菌株屎腸球菌R2，該菌株可用于酸漿豆腐及豆干等的生產(chǎn)[14]，減少致病菌及雜菌含量，保證酸漿的質(zhì)量及穩(wěn)定性，進(jìn)而提高豆制品的安全性。屎腸球菌R2在發(fā)酵黃漿水的過(guò)程中無(wú)需補(bǔ)充蔗糖、葡萄糖等碳源，且在發(fā)酵結(jié)束后無(wú)需補(bǔ)充醋酸即可達(dá)到適宜的酸度，有效地降低了生產(chǎn)成本[15]，因此，屎腸球菌R2作為一種新型酸漿純種發(fā)酵劑，對(duì)于黃漿水的開發(fā)利用及酸漿豆腐的規(guī)范化生產(chǎn)具有重要意義。為了更好地利用該菌株，保證酸漿豆制品的安全性，本研究通過(guò)毒力基因和耐藥基因篩查實(shí)驗(yàn)，有害代謝產(chǎn)物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，確定該菌株是否具有安全性；通過(guò)對(duì)外界環(huán)境耐受性和生理功能特性實(shí)驗(yàn)，確定該菌株的耐受性，為屎腸球菌R2應(yīng)用于酸漿豆腐生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

屎腸球菌EnterococcusfaeciumR2，CGMCC No.14944(專利保藏菌種)、屎腸球菌(E.faecium)CICC 24252，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，作為陽(yáng)性對(duì)照菌；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、牛膽鹽、PCR反應(yīng)相關(guān)試劑，上海生工；成品血瓊脂培養(yǎng)基、對(duì)二氨基苯甲醛、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-酪氨酸、L-鳥氨酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸粉5，K2HPO42，檸檬酸二銨2，葡萄糖 20，牛肉膏10，CH3COONa 5，MgSO40.2，MnSO40.05，瓊脂粉 20，CaCO320，吐溫-80 1 mL。

氨基酸培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，酵母膏3，葡萄糖1，1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1，pH 6.8，分別添加0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的酪氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸配成5組氨基酸培養(yǎng)基。

硝酸鹽培養(yǎng)基：在1 000 mL的MRS培養(yǎng)基中加入KNO40.2 g，加熱攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4，配制成硝酸鹽培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZW-60KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺(tái)，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；，EX Zone2電子天平，深圳安普特電子科技有限公司；BSC-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；GZX-DH500-BS-Ⅱ電熱恒溫干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠； pHS-3C pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ABI型PCR儀，美國(guó)ABI公司；GEL DOC XR凝膠成像系統(tǒng)， 美國(guó)Bio-rad；5804R型離心機(jī)，Eppendorf公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 安全性評(píng)價(jià)

1.3.1.1 毒力基因檢測(cè)

將屎腸球菌R2接種到MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下靜置培養(yǎng)16 h，離心收集沉淀，按照細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒方法提取屎腸球菌R2基因組DNA。以基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增屎腸球菌R2的毒力基因，毒力基因的引物序列如表1所示，引物均由安徽滁州通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。RCR反應(yīng)體系：10 μmol/L上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、2×Taq PCR StarMix 10 μL、補(bǔ)充ddH2O 至25 μL，設(shè)陰性對(duì)照。退火溫度分別為52 ℃(gelE和efaA)、56 ℃(cylA、asa1和esp)、58 ℃(hyl)。其余PCR條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，退火30 s，72 ℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃充分延伸5 min。PCR結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物置于含EB的1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并拍照分析。

1.3.1.2 耐藥性基因檢測(cè)

以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增屎腸球菌R2的萬(wàn)古霉素耐藥基因，耐藥基因的引物序列如表2所示，引物均有安徽滁州通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。RCR反應(yīng)體系：10 μmol/L上下游引物各1.0 μL、模板DNA 1.0 μL、2×Taq PCR StarMix 12.5 μL、補(bǔ)充ddH2O 至25 μL。陰性對(duì)照模板以1.0 μL ddH2O代替。PCR條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃充分延伸10 min；4 ℃保存。PCR結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物置于含EB的1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并拍照分析。

表1 六種常見毒力基因引物序列Table 1 Sequences of six common virulence genes

表2 耐藥基因引物序列Table 2 Sequences of vancomycin resistant genes

1.3.1.3 有害代謝產(chǎn)物檢測(cè)

氨基酸脫羧酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn):無(wú)菌條件下，將活化后的屎腸球菌R2菌懸液按3%接種量分別接入5組氨基酸培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h和48 h，觀察培養(yǎng)顏色變化[20-21]，以MRS培養(yǎng)基作為對(duì)照組。

硝酸鹽還原酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn):無(wú)菌條件下，將活化后的屎腸球菌R2菌懸液按3%的接種量接入到硝酸鹽培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后，先滴加10滴5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的KI溶液，再滴加10滴5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的淀粉溶液，充分振蕩混勻后觀察培養(yǎng)基顏色變化[22]，以不接菌的培養(yǎng)基作為對(duì)照組。

吲哚實(shí)驗(yàn)：在無(wú)菌條件下，將活化后的屎腸球菌R2菌懸液按3%接種量接入到蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h后，向培養(yǎng)基中加入2 mL乙醚，充分振蕩，靜置片刻，使乙醚浮于上層液面，此時(shí)再沿管壁緩慢加入10滴吲哚試劑(切勿搖動(dòng))，觀察兩層交界處顏色變化[23]，以不接菌的培養(yǎng)基作為對(duì)照組。

溶血實(shí)驗(yàn)：在無(wú)菌條件下，用滅菌后的接種環(huán)挑取活化后的屎腸球菌R2菌懸液在血瓊脂平板上劃線，倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，觀察菌落周圍有無(wú)溶血圈，拍照記錄反應(yīng)現(xiàn)象。若在菌株菌落周圍的瓊脂顯示綠色，則為α-溶血；在菌落周圍出現(xiàn)透明圈，為β-溶血；如果對(duì)溶血無(wú)作用或不溶血，為γ-溶血[24-25](用金黃色葡萄球菌作為陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行比較)。

1.3.2 環(huán)境脅迫耐受性

1.3.2.1 耐酸性

將活化后的屎腸球菌R2按3%接種量接分別接種到pH為2.0、2.5、3.0、3.5的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，分別在 0、1、2、3 h處取樣，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定樣品中的菌體數(shù)量[25-26]。以未經(jīng)調(diào)整過(guò)的MRS液體培養(yǎng)基(pH約為6.8)作為對(duì)照。

1.3.2.2 膽鹽耐受性

將活化胡的屎腸球菌R2按3%接種量分別接種到含有0.1%、0.2%、0.3%、1.0%、2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)3 h后，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定樣品中的菌體數(shù)量。以不加膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基作對(duì)照，計(jì)算存活率。存活率計(jì)算如公式(1)：

(1)

式中：N1為處理組的細(xì)菌數(shù)；N0為對(duì)照組的細(xì)菌數(shù)。

1.3.2.3 耐高鹽評(píng)價(jià)

將活化后的屎腸球菌R2按3%接種量分別接種到含有1%、2%、3%、4%、5 % NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定樣品中的菌體數(shù)量[26]。以不含NaCl的MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.3.3 生理特性評(píng)價(jià)

1.3.3.1 自聚集性

將活化后的屎腸球菌R2在3 000 r/min下離心 10 min，蒸餾水洗滌2次，再懸浮，用蒸餾水稀釋，調(diào)整OD值在660 nm下為 0.3(記為OD0)。在37 ℃下孵育60 min后，再次測(cè)量660 nm下的OD值(記為OD60)[26]。自聚集計(jì)算如公式(2)：

(2)

1.3.3.2 疏水性

采用碳?xì)浠衔镳ぶ?。取活化好的屎腸球菌R2菌液，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次。生理鹽水作空白對(duì)照，用生理鹽水調(diào)整菌體濃度，使A560nm值約為1.00。取2 mL調(diào)整后的菌液，加入2 mL二甲苯，渦旋振蕩2 min后室溫靜置 180 min，使得有機(jī)相跟水相明顯分界。取水相，在560 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值[27]。疏水率如計(jì)算公式(3)：

(3)

式中：A0和A分別是二甲苯混勻前、混勻后菌液在560 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的A值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 16.0軟件中的AVOVA單因素方差分析及LSD多重檢驗(yàn)(P<0.05)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和方差顯著性分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 屎腸球菌R2的安全性評(píng)價(jià)

2.1.1 毒力基因檢測(cè)

屎腸球菌R2的毒力基因檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，屎腸球菌R2不攜帶腸球菌常見的6種毒力基因，而陽(yáng)性對(duì)照菌(屎腸球菌CICC 24252)檢測(cè)到了esp基因，esp基因?qū)?yīng)的毒力因子是腸球菌表面蛋白，主要起到黏附宿主細(xì)胞的作用[16]。

M-DL 2000 Marker；1、2、3、4、5、6-gelE、esp、asa1、 cylA、 efaA、hyl的檢測(cè)結(jié)果a-陽(yáng)性對(duì)照菌(E. faecium CICC 24252)；b-受試菌屎腸球菌R2圖1 屎腸球菌R2的毒力基因擴(kuò)增電泳圖譜Fig.1 Specific amplified results of virulence genes fromE. faecium R2

2.1.2 耐藥基因檢測(cè)

前期藥敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示屎腸球菌R2對(duì)四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、青霉素及鏈霉素4種常見抗生素藥物敏感[15]。大量研究表明屎腸球菌引起的感染非常依賴萬(wàn)古霉素耐藥性，因此進(jìn)一步對(duì)屎腸球菌R2的萬(wàn)古霉素耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，屎腸球菌R2的vanA、vanB、vanC、vanC2/3、vanD、vanE和vanG基因擴(kuò)增均為陰性。

M-DL 2000 Marker；1、3、5、7、9、11、13-受試屎腸球菌R2的vanA、vanB、vanC、vanC2/3、vanD、vanE和vanG的檢測(cè)結(jié)果；2、4、6、8、10、12、14-陽(yáng)性對(duì)照菌(E. faecium CICC 24252)的vanA、vanB、vanC、vanC2/3、vanD、vanE和vanG的檢測(cè)結(jié)果圖2 屎腸球菌R2的萬(wàn)古霉素耐藥基因擴(kuò)增電泳圖譜Fig.2 Specific amplified results of vancomycin resistant genes from E. faecium R2

2.1.3 有害代謝產(chǎn)物檢測(cè)

吲哚實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)菌株是否能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸。色氨酸為人體必需氨基酸，參與人體蛋白質(zhì)合成、調(diào)節(jié)免疫功能和促進(jìn)消化。色氨酸代謝過(guò)程發(fā)生障礙會(huì)引起肝功能衰退、惡性腫瘤等[28]。吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示為陰性(見表3)，向培養(yǎng)好的菌液中滴加指示劑，沒(méi)有紅色圓環(huán)產(chǎn)生，說(shuō)明沒(méi)有產(chǎn)生吲哚類物質(zhì)，表明屎腸球菌R2不會(huì)分解色氨酸產(chǎn)生吲哚。

硝酸鹽還原酶能夠催化硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽是強(qiáng)致癌物亞硝胺的前提物質(zhì)，與食品中蛋白質(zhì)分解的中間產(chǎn)物仲胺反應(yīng)形成亞硝胺，后者可又發(fā)胃癌、肝癌、咽喉癌等多種癌癥[29]。結(jié)果顯示菌液均未變藍(lán)，為陰性反應(yīng)(見表3)，說(shuō)明屎腸球菌R2的代謝產(chǎn)物中不含有硝酸還原酶或硝酸還原酶無(wú)活性。

一些乳酸菌具有氨基酸脫羧酶活性，能夠?qū)⑹称分械陌被崦擊冗€原成生物胺類物質(zhì)，如果胺類在體內(nèi)積累過(guò)多，就會(huì)引起中毒的癥狀。而具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌，能夠分解氨基酸使其脫羧生成胺(賴氨酸→尸胺，鳥氨酸→腐胺，精氨酸→精胺)和二氧化碳，進(jìn)而使培養(yǎng)基變堿性，當(dāng)?shù)渭又甘緞?溴甲酚紫)，呈黃色為陰性，呈紫色為陽(yáng)性[27]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示測(cè)定管呈黃色(見表4)，為陰性，說(shuō)明屎腸球菌R2的代謝產(chǎn)物中不含有氨基脫羧酶，即對(duì)人體無(wú)害。

表3 有害代謝產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of harmful metabolites

溶血現(xiàn)象是人體內(nèi)一種不正常的現(xiàn)象，溶血素生產(chǎn)能力越強(qiáng)，紅血球破壞越嚴(yán)重，溶血現(xiàn)象就越嚴(yán)重，人體一旦感染，就會(huì)造成非常嚴(yán)重的敗血癥，因此溶血現(xiàn)象是乳酸菌安全性評(píng)價(jià)的重要檢測(cè)指標(biāo)之一。如圖3所示，屎腸球菌R2在血平板上培養(yǎng)48 h后長(zhǎng)出乳白色菌落且沒(méi)有溶血圈，屬于沒(méi)有毒性的γ-溶血，說(shuō)明該菌株對(duì)溶血無(wú)作用或不溶血，而金黃色葡萄球菌則表現(xiàn)出β-溶血。

a-屎腸球菌R2；b-金黃色葡萄球菌圖3 溶血實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The result of hemolysis test

2.2 屎腸球菌R2的環(huán)境脅迫耐受性

2.2.1 耐酸性實(shí)驗(yàn)

人體胃液pH的大小根據(jù)飲食結(jié)構(gòu)的不同而變化，通常維持在3.0左右?？崭够蚴秤盟嵝允称泛髉H可達(dá)到1.5，食用堿性食品后pH可達(dá)到4～5，食物通過(guò)胃的時(shí)間一般為1～2 h。表4為屎腸球菌R2在不同pH條件下培養(yǎng)不同時(shí)間的活菌數(shù)。由表4可知，屎腸球菌R2在pH 6.8(對(duì)照組)和pH 3.5的MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，活菌數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但是與對(duì)照組相比，pH 3.5的培養(yǎng)基中屎腸球菌R2的活菌數(shù)有所下降；在pH為2.0、2.5和3.0的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，活菌數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降減少。

由表4可以看出，即使在pH 2.0的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后，屎腸球菌R2的活菌數(shù)仍然保持在108CFU/mL以上，而益生菌在人體內(nèi)發(fā)揮作用的濃度要求一般為106～109CFU/mL。由此可知，屎腸球菌R2對(duì)人體生理濃度范圍內(nèi)的酸性變化有較好的耐受性。

表4 屎腸球菌R2在不同酸度條件下的存活數(shù)Table 4 Survival of E. faecium R2 in different acidic environments

注：同列肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，表5、表6同。

2.2.2 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

小腸是益生菌發(fā)揮作用的重要場(chǎng)所，正常人體小腸中膽汁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在0.1%～0.3%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，屎腸球菌R2在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后，存活率為91.95%；在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%和2.0%膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后，仍有82%以上的存活率?？梢?，屎腸球菌R2對(duì)膽鹽具有很強(qiáng)的耐受能力。

表5 屎腸球菌R2在不同膽鹽濃度下的存活率Table 5 Viability of E. faecium R2 under different bile salt concentrations

2.2.3 耐高鹽實(shí)驗(yàn)

人體腸胃道中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在1.0%～4.0%。NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化會(huì)影響滲透壓的大小，微生物對(duì)于滲透壓的耐受能力是有限的，滲透壓過(guò)高會(huì)造成微生物停止生長(zhǎng)甚至死亡[30]。屎腸球菌R2在不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的活菌數(shù)如表6所示，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4.0%以下，屎腸球菌R2的活菌數(shù)隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.0%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到了109CFU/mL以上。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，屎腸球菌R2的活菌數(shù)明顯下降(P<0.05)，但仍然維持在108CFU/mL以上。由此可見，屎腸球菌R2具有較強(qiáng)的耐高鹽能力，在胃腸道的高鹽環(huán)境中能夠有效地消除高滲透壓所帶來(lái)的不利影響，可以維持菌體滲透壓的相對(duì)平衡。

表6 屎腸球菌R2在不同鹽濃度下的存活數(shù)Table 6 Survival of E. faecium R2 in different salt concentraion

2.3 屎腸球菌R2的生理特性

自聚集是生物膜形成的一個(gè)重要特性，而乳酸菌的生物膜可以通過(guò)保護(hù)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)中的菌株，產(chǎn)生某種抗菌化合物和刺激免疫應(yīng)答從而進(jìn)行腸道定植[29]，因此，自聚集性可以反映細(xì)菌的黏附性能。屎腸球菌R2菌懸液在37 ℃條件下孵育60 min后，它的自聚集性為15.94%。同樣條件下，田原等[31]測(cè)定的副干酪乳桿菌L1的自聚集性為15.8%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近；任大勇[32]測(cè)定的鼠李糖乳桿菌GG孵育在120 min后自聚集性可達(dá)到33%。由此可知，屎腸球菌R2具有一定的自聚集性。PEREZ等研究表明，菌株疏水性的大小來(lái)推斷其黏附能力的高低，疏水性在細(xì)菌發(fā)揮黏附作用和自聚集反應(yīng)中都具有重要作用，即疏水性高的菌株對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附作用就強(qiáng)，且這種關(guān)聯(lián)呈現(xiàn)一定的依賴性[33]。屎腸球菌R2菌懸液的疏水性為7.31%，可以看出該菌具有一定的疏水性，但相對(duì)偏低。

3 結(jié)論與討論

屎腸球菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群，并廣泛存在于許多傳統(tǒng)發(fā)酵食品中。腸球菌具有蛋白酶、脂肪酶活性及產(chǎn)生二乙酰等代謝能力，在奶酪加工、發(fā)酵肉類的后熟和產(chǎn)品的特殊風(fēng)味及香氣形成中發(fā)揮重要作用[34]。有些屎腸球菌可以產(chǎn)生腸球菌素，可以抑制奶酪表面單增李斯特菌的生長(zhǎng)和繁殖，對(duì)奶酪的保鮮具有一定效果[7]。另外，屎腸球菌生物學(xué)特性良好，對(duì)于高溫、高鹽、酸堿和氧氣具有較好的抗逆性，董曉芬等[35]從枳椇果梗中篩選出一株富硒能力強(qiáng)且適宜發(fā)酵枳椇液的屎腸球菌，可耐受pH 2.5的酸和0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膽鹽。此外，有報(bào)道表明厭氧條件下屎腸球菌E.faeciumEPI1與LactobacillusmucosaeEPI2等菌株混合發(fā)酵可產(chǎn)生雌馬酚[36]，雌馬酚為大豆異黃酮代謝終產(chǎn)物，具有比其他異黃酮類物質(zhì)和其前體物質(zhì)大豆苷元更強(qiáng)的類雌激素活性。實(shí)驗(yàn)所用菌株屎腸球菌R2具有α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性，可代謝豆腐黃漿水中的棉籽糖和水蘇糖，同時(shí)將活性低的糖苷型大豆異黃酮(主要為大豆苷和染料木苷)轉(zhuǎn)化為高活性游離型苷元大豆異黃酮，對(duì)改善豆制品的品質(zhì)具有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)屎腸球菌R2的安全性評(píng)價(jià)可知，該菌在毒力基因檢測(cè)和萬(wàn)古霉耐藥基因篩查實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性；在有害代謝產(chǎn)物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也均為陰性，且為無(wú)毒的γ-溶血；且該菌對(duì)外界環(huán)境中的酸性、膽鹽及高滲透壓耐受性良好，也體現(xiàn)了一定的聚集性和疏水性，因此，屎腸球菌R2表現(xiàn)了良好的安全性和環(huán)境耐受性，具有潛在的應(yīng)用前景。