司倩，焦婷，楊樹榮，孫珊珊，王剛，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，主要包括Ⅰ型糖尿病(type I diabetes, T1D)和Ⅱ型糖尿病(type Ⅱ diabetes, T2D)，其中大部分為T2D[1]。T2D的發(fā)病機(jī)制主要為自身免疫破壞的胰島功能缺陷和敏感性不足導(dǎo)致的胰島素抵抗,進(jìn)而導(dǎo)致明顯的高血糖[2]。國際糖尿病聯(lián)合會(huì)(International Diabetes Federation，IDF)的調(diào)查結(jié)果顯示，2017年全球約有4.25億年齡大于19歲的人患有糖尿病，如果繼續(xù)維持這種發(fā)展趨勢，約30年后，糖尿病患者人數(shù)將高達(dá)6.93億[3]。因此控制糖尿病已迫在眉睫。

已有研究表明，腸道微生物失調(diào)與多種疾病有關(guān)，包括多種腸道疾病(腸炎、大腸癌)[4]和代謝類疾病(糖尿病、肥胖和非酒精性脂肪性肝病等)[5]。模型動(dòng)物的研究表明，與正常小鼠相比，T2D小鼠體內(nèi)的腸道微生物組成發(fā)生了很大的變化，主要體現(xiàn)為厚壁菌門與擬桿菌門的比值增加，產(chǎn)丁酸細(xì)菌屬的豐度也會(huì)產(chǎn)生變化，這與T2D患者的腸道菌群變化結(jié)果是一致的[6]。

雙歧桿菌是一種可食用的益生菌，部分研究報(bào)道該屬的部分菌株可有效緩解腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象[7]。研究表明，含兩歧雙歧桿菌的復(fù)配配方能有效增強(qiáng)T2D小鼠的胰島素敏感性[8]，降低空腹血糖，調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化能力，修復(fù)脂質(zhì)代謝，緩解炎癥，甚至起到改變SCFAs組成，改善腸道菌群失調(diào)的作用[9]。然而，大量的研究也表明，益生菌的功能具有顯著的菌株特異性，兩歧雙歧桿菌是否都具有緩解T2D的作用尚不明確，且關(guān)于單一的兩歧雙歧桿菌抗糖尿病的研究并不多，具體的改善途徑也不明確。因此，本研究分析了3株不同來源的兩歧雙歧桿菌在單菌情況下緩解T2D能力的差異，并希望借此找到兩歧雙歧桿菌緩解T2D的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

STZ,美國Sigma公司； 60%高脂飼料,南通特洛菲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料高科技平臺(tái)；血糖儀和試紙,美國羅氏公司；TNF-a、IL-1β試劑盒,美國RD公司；胰島素試劑盒,南京森貝伽生物科技有限公司；總蛋白試劑盒,南京碧云天生物技術(shù)有限公司；TC、TG、HDL-C、LDL-C試劑盒,南京建成生物工程研究所；引物,上海生工生物工程。

5415R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)，上海智誠科技有限公司；RC BIOS 10型落地式離心機(jī)，美國Thermo公司；1300-ISQ型Thermo/Trace GC-MS，美國Thermo公司；3020型多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；PE300型MiSeq高通量測序平臺(tái)，美國Illumina公司；2100型Agilent(安捷倫)生物分析儀，美國Agilent科技有限公司；Gel DocTMEZ imager型凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.2 乳酸菌懸浮液的制備

實(shí)驗(yàn)用3株菌株(BB1：B.bifidumJSYC2M2、BB13：B.bifidumBB13、H35：B.bifidumH35),均來源于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種保藏庫。菌株于固體培養(yǎng)基上劃線分離后，挑取單菌落于液體MRS培養(yǎng)基中，于 37 ℃、24 h條件下活化，48 h活化2代后接種于MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h進(jìn)行擴(kuò)培(37 ℃)，將培養(yǎng)好的兩歧雙歧桿菌在4 ℃，5 000 r/min條件下離心10 min,所得菌泥用PBS清洗2次，用傾注計(jì)數(shù)方法調(diào)整總活菌量在5×1010CFU/mL，于菌泥中加入 30 %的蔗糖保護(hù)劑后保藏于-80℃?zhèn)溆茫还辔盖皩⒕弘x心，然后用3%蔗糖重懸后使用。

1.3 動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案，如圖1所示。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作嚴(yán)格遵守江南大學(xué)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的章程(SYXK 2012-0002)。48只3周齡的無特定病原(specific pathogen free，SPF)級(jí)C57BL/6J小鼠,購自上海斯萊克動(dòng)物中心。小鼠分為6組(每組8只)：正常組、模型組、羅格列酮藥物組、BB1組、BB13組和H35組。所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，從第2周開始，正常組小鼠喂食普通對(duì)照飼料，其余小鼠喂食60%高脂飼料。在第11周的第1天：所有小鼠禁食不禁水12 h，空白組注射50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)，其余組按照100 mg/kg(bw)的劑量注射50 mmol/L STZ(冰上避光，現(xiàn)配現(xiàn)用)，STZ用50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解。STZ注射后1周，小鼠禁食不禁水測定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)，以FBG>7.0 mmol/L且糖負(fù)荷2 h后血糖>11.1 mmol/L即為造模成功[10]。從第2周開始至16周試驗(yàn)結(jié)束，小鼠每周灌胃6次，劑量為0.2 mL，各組小鼠灌胃樣品如下：

(1)空白組和模型組：灌胃3%的蔗糖溶液；

(2)羅格列酮藥物組：灌胃含10 mg/kg(bw)羅格列酮的3%蔗糖溶液；

(3)BB1組：灌胃含有兩歧雙歧桿菌BB1(5×109CFU/mL)的3%蔗糖溶液；

(4)BB13組：灌胃含有兩歧雙歧桿菌BB13(5×109CFU/mL)的3%蔗糖溶液；

(5)H35組：灌胃含有兩歧雙歧桿菌H35(5×109CFU/mL)的3%蔗糖溶液。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Fig.1 Animal experimental design

1.4 樣品采集及處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，采集新鮮糞便樣品于2 mL滅菌的干燥EP管中，立刻冰上放置并快速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?dòng)物禁食不禁水12 h后，采用質(zhì)量濃度為10 g/L的戊巴比妥鈉溶液 0.5 mL/10 g對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，取血后輔以頸椎脫臼法處死。全血取出后分成2份，一份全血裝于抗凝管中直接置于-80 ℃保存，另一份經(jīng)3 000 r/min離心15 min后，收集上層血清，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將胰腺組織用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水漂洗后保存在4%多聚甲醛溶液中；對(duì)肝臟組織稱重并將其和結(jié)腸組織各分為2份，一份保存在4%多聚甲醛溶液中用于組織切片，另一份經(jīng)液氮冷凍后，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 空腹血糖及口服糖耐量測定

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間，每周第1天檢測小鼠的空腹血糖(fasting blood alucose,FBG)，小鼠禁食不禁水12 h后，用采血針以尾部取血的方式，用羅氏血糖儀進(jìn)行檢測；在STZ注射后1周和試驗(yàn)結(jié)束前1周時(shí)進(jìn)行口服糖耐量實(shí)驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT)：小鼠禁食不禁水12 h后，檢測0 min時(shí)的初始血糖，然后按照2 g/kg(bw)的用量灌胃30%葡萄糖溶液，分別在30、60和120 min后檢測血糖值。

1.6 生化分析

全血取出后分成2份，一部分全血直接用于測定糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)，另一部分3 000 r/min離心15 min離心后吸取上層血清保存在-80 ℃?zhèn)溆?，后續(xù)用ELISA試劑盒對(duì)胰島素、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)等指標(biāo)進(jìn)行定量測定。

1.7 肝臟勻漿中炎癥因子和抗氧化指標(biāo)的測定

稱取一定量肝臟組織，按1∶9 (質(zhì)量比)加入生理鹽水進(jìn)行組織研磨，3 000 r/min離心10 min，取上清，采用ELISA試劑盒測定肝臟勻漿中腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor-α，TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)水平，按照試劑盒說明書的方法檢測肝臟勻漿中丙二醛(malondialdehyde，MDA)和總蛋白的水平。

1.8 組織病理學(xué)分析

用4%多聚甲醛溶液固定胰腺、肝臟組織，用石蠟包埋，然后用蘇木精-伊紅染色。在物鏡(×40)下，分別拍攝肝臟和胰腺具有代表性的顯微照片并進(jìn)行病理學(xué)分析。

1.9 短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)的測定

采用氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)糞便中乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸進(jìn)行分析，小鼠糞便中短鏈脂肪酸的萃取和測定參考文獻(xiàn)稍作修改[11]：取50 mg糞便樣品于飽和NaCl溶液浸泡打碎至無明顯塊狀物；加入20 μL H2SO4溶液酸化；加入1 000 μL乙醚旋渦萃??；13 000×g離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至裝有0.25 g無水Na2SO4的EP管中，再以同樣的條件離心取上層乙醚相，加入到氣相樣品瓶中，于GC-MS儀器上測定SCFAs的含量。

1.10 腸道菌群的測定

根據(jù)前人的測定方法檢測小鼠糞便樣品中的腸道菌群[12]。按照Fast DNA Spin試劑盒的說明書提取小鼠糞便中細(xì)菌的基因組,對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓 120 V、30 min，采用凝膠成像儀拍照并記錄電泳結(jié)果、按照GeneClean Turbo試劑盒的說明書進(jìn)行V4區(qū)PCR產(chǎn)物的膠回收與定量檢測，按等質(zhì)量濃度原則混樣，構(gòu)建文庫并用MiSeq測序儀上機(jī)測序。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，用GraphPad Prism 5繪圖，用SPSS的單因素ANOVA和Duncan’s多量程檢驗(yàn)對(duì)各組數(shù)據(jù)的差異進(jìn)行分析，以不同字母標(biāo)注表示具有顯著差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠血糖水平和HbA1c的影響

空腹血糖(FBG)是衡量血糖狀態(tài)的關(guān)鍵性指標(biāo)，之前也有大量研究表明益生菌具有降低FBG的效果，如L.rhamnosusMTCC-5897[13]和L.caseiCCFM0412[14]都可以改善T2D小鼠的FBG。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，STZ注射1周后，所有組的FBG均與空白組呈現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)，BB1和H35處理組與模型組表現(xiàn)出顯著性差異，其中BB1組預(yù)防FBG升高的效果與羅格列酮藥物組類似。STZ注射后2～5周，模型組小鼠的FBG遠(yuǎn)高于空白組(P<0.05)，雖然BB13組、H35組在此期間能觀察到對(duì)FBG水平的降低作用，但隨著時(shí)間的推移，和模型組FBG的差異逐漸消失，這說明這2株兩歧雙歧桿菌隨著造模時(shí)間的延長，已無法阻止高脂飲食和STZ注射造成的機(jī)體糖代謝紊亂。相反，與羅格列酮藥物組相似，兩歧雙歧桿菌BB1在STZ注射后第5周仍有較好的降FBG效果，甚至可使小鼠的FBG恢復(fù)至正常水平，這表明兩歧雙歧桿菌BB1具有優(yōu)于BB13和H35的延緩糖尿病進(jìn)程的作用，其甚至可發(fā)揮與羅格列酮藥物相當(dāng)?shù)慕笛亲饔谩?/p>

HbA1c濃度通?？梢苑从橙忧?～3月的平均血糖水平[15]。如圖2所示，本研究模型組小鼠的HbA1c明顯高于空白組，而BB1組的HbA1c相比模型組有顯著降低(P<0.05),效果與藥物組類似。前人研究表明，L.rhamnosusCCFM0528喂養(yǎng)糖尿病小鼠后，小鼠的空腹血糖水平和HbA1c濃度顯著降低[16]，這與我們的研究結(jié)果相一致。

為了進(jìn)一步研究3株兩歧雙歧桿菌是否能發(fā)揮延緩糖尿病發(fā)生、改善糖尿病的作用，在實(shí)驗(yàn)第11周(STZ注射后1周)和實(shí)驗(yàn)第16周(STZ注射后5周)進(jìn)行了口服糖耐量測定。如圖3-a和圖3-b所示，模型組、藥物組、灌菌組小鼠在11周時(shí)血糖耐受性受損；模型組血糖曲線下面積(glucose undercurve，AUCglucose)明顯高于空白組(P<0.05)。與BB13組不同的是，BB1組和H35組的AUC葡萄糖值顯著低于模型組(P<0.05)，這表明這2株兩歧雙歧桿菌均能預(yù)防小鼠糖耐量受損的情況。由圖3-c可知，STZ注射5周后，模型組在30 min時(shí)血糖水平急劇上升，小鼠口服藥物和兩歧雙歧桿菌可明顯抑制口服葡萄糖后血糖水平的升高。與模型組相比，羅格列酮藥物組、BB1、BB13和H35組的AUC葡萄糖值分別降低了44.48%、33.56%、14.75%和13.13%，數(shù)據(jù)顯示，羅格列酮、BB1、BB13和H35處理的小鼠比未治療的糖尿病小鼠均有更好的葡萄糖代謝能力，其中BB1灌菌組的效果與羅格列酮藥物組相似，顯著改善了由STZ和高脂飲食誘導(dǎo)的糖耐量受損情況(P<0.05)。

表1 STZ注射后小鼠空腹血糖 單位：mmol/L

注：同行肩標(biāo)的不同小寫字母表示不同組之間差異顯著(P< 0.05)。下同。

圖2 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠HbA1c的影響Fig.2 Effect of different Bifidobacterium bifidum on HbA1cin T2D mice注：圖中不同小寫字母表示不同組之間差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠胰島素抵抗的影響

據(jù)報(bào)道，L．rhamnosusGG有著較好的降血糖效果，且能夠顯著改善胰島素抵抗情況[17]。為了檢驗(yàn)BB1、BB13和H35治療是否也能夠顯著改善糖尿病小鼠的胰島素抵抗情況，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，我們測定了空腹胰島素水平，并計(jì)算了胰島素抵抗指數(shù)(homeostatic model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)值。如表2所示，與空白組相比，模型組、藥物組和BB13灌菌組胰島素含量顯著上升(P<0.05)，BB1和H35灌菌組在一定程度上降低了糖尿病小鼠的胰島素水平，從胰島素抵抗指數(shù)來看，3株兩歧雙歧桿菌中只有BB1可顯著改善糖尿病小鼠的胰島素抵抗(P<0.05)，其效果與藥物組相當(dāng)。

a-STZ注射后1周小鼠OGTT血糖變化；b-STZ注射后1周小鼠OGTT曲線下面積；c- STZ注射后5周小鼠OGTT血糖變化;d- STZ注射后5周小鼠OGTT曲線下面積圖3 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠糖耐量的影響Fig.3 Effect of different Bifidobacterium bifidum on glucose tolerance in T2D mice

表2 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠胰島素抵抗的影響Table 2 Effect of different Bifidobacterium bifidum oninsulin resistance in mice

2.3 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠血脂的影響

血脂異常是 Ⅱ 型糖尿病的一個(gè)常見特征，也是 Ⅱ 型糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的主要原因。血清TG、TC、HDL-C和LDL-C這4個(gè)指標(biāo)通常用來詮釋血脂狀態(tài)。與空白組小鼠相比，模型組小鼠具有明顯較高的TC、LDL-C水平以及較低的HDL-C水平(P<0.05)，這些結(jié)果表明糖尿病小鼠的體內(nèi)血脂代謝也出現(xiàn)異常。本研究中的藥物未發(fā)揮改善血脂代謝異常的作用，而兩歧雙歧桿菌處理組主要通過恢復(fù)HDL-C水平來發(fā)揮相應(yīng)的作用。本文研究結(jié)果表明，兩歧雙歧桿菌并非對(duì)所有的血脂指標(biāo)都具有調(diào)節(jié)作用，并且不同兩歧雙歧桿菌對(duì)血脂代謝發(fā)揮作用的能力也不盡相同。

表3 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠血脂狀態(tài)的影響 單位：mmol/L

2.4 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠氧化應(yīng)激的影響

T2D的誘因有多種假說，其一就是氧化應(yīng)激假說。氧化應(yīng)激主要由體內(nèi)自由基大量增加,同時(shí)機(jī)體的抗氧化能力受損導(dǎo)致。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物[18-19]；由圖4可知，模型組小鼠的MDA明顯高于正常組(P<0.05)，表明模型組小鼠體內(nèi)出現(xiàn)一定程度的氧化損傷，而服用羅格列酮藥物后，氧化損傷出現(xiàn)顯著的改善和恢復(fù)。采用BB1和H35處理糖尿病小鼠后， MDA水平明顯降低(P< 0.05)。從以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，BB1和H35這2株兩歧雙歧桿菌均可以在一定程度上發(fā)揮抗氧化作用。

圖4 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠肝臟MDA的影響Fig.4 Effect of different Bifidobacterium bifidum on liver MDA in T2D mice

2.5 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠肝臟炎癥的影響

T2D伴有一種持續(xù)性的慢性低度炎癥，無論是在糖尿病發(fā)展的初期還是在糖尿病后期導(dǎo)致的并發(fā)癥中，炎癥反應(yīng)都發(fā)揮重要作用，通常表現(xiàn)為IL-1β、TNF-α等細(xì)胞因子水平增高[20]。如表4所示，模型組小鼠肝臟勻漿中IL-1β和TNF-α的水平明顯高于空白組(P<0.05)，口服BB1顯著降低了這3種細(xì)胞因子的水平(P<0.05)，效果優(yōu)于藥物組，含量接近于空白組。這些結(jié)果表明，3株兩歧雙岐桿菌只有BB1才能顯著改善糖尿病模型小鼠的炎癥反應(yīng)。

表4 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠肝臟炎癥水平的影響 單位：pg/mg蛋白質(zhì)

2.6 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠組織損傷的影響

T2D的主要指標(biāo)，除了胰島素抵抗外，還包括由于長期胰島素抵抗而導(dǎo)致的胰島損傷[21]。因此，我們通過HE染色觀察BB1、BB13和H35對(duì)胰島形態(tài)的影響。如圖5所示，與正常組相比，模型組小鼠在胰腺形態(tài)和胰島數(shù)量發(fā)生了明顯的變化，而用BB1、BB13和H35處理后，小鼠胰腺細(xì)胞受損情況得到了明顯的改善，并且BB1改善受損胰島細(xì)胞的能力要強(qiáng)于BB13和H35，表現(xiàn)出明顯的菌株差異性。由圖6可知，模型組小鼠的肝臟出現(xiàn)大量的脂肪空泡變性，而BB1、BB13和H35菌處理組明顯改善了小鼠肝臟的病變情況，其中BB1效果最佳，值得一提的是，羅格列酮藥物組呈現(xiàn)出比模型組更嚴(yán)重的肝臟病變情況，這表明雖然藥物組具有較好的降血糖效果，但是長期服用藥物會(huì)對(duì)小鼠肝臟產(chǎn)生比較嚴(yán)重的損傷。

a-空白組；b-模型組；c-藥物組；d-BB1組；e-BB13組；f-H35組圖5 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠胰島形態(tài)的影響Fig.5 Effect of different Bifidobacterium bifidum on the islet morphology in T2D mice

a-空白組；b-模型組；c-藥物組；d-BB1組；e-BB13組；f-H35組圖6 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠肝臟形態(tài)的影響Fig.6 Effect of different Bifidobacterium bifidum on the liver morphology in T2D mice

2.7 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠短鏈脂肪酸的影響

腸道內(nèi)的短鏈脂肪酸(SCFAs)，主要由未消化的淀粉經(jīng)過厭氧微生物發(fā)酵產(chǎn)生[22]。腸道內(nèi)的主要短鏈脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸。研究表明，短鏈脂肪酸可以促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖，維持腸道屏障的完整性[23]；可以激活肝臟和胰腺上的受體改善糖脂代謝，緩解胰島素抵抗[24]；可以通過結(jié)合游離脂肪酸受體2(recombinant free fatty acid receptor 2，F(xiàn)FAR2)降低疾病的炎癥反應(yīng)[25]。如表5所示，本研究中模型組小鼠幾種短鏈脂肪酸的含量都低于正常組小鼠，而3株兩歧雙歧桿菌中只有BB1對(duì)乙酸、丙酸和丁酸水平具有明顯的恢復(fù)作用(P<0.05)。據(jù)報(bào)道，丁酸鹽具有抗炎、抗氧化的作用[26]，這些結(jié)果表明，BB1可能通過增加短鏈脂肪酸水平，緩解了炎癥狀態(tài)，進(jìn)而緩解了胰島素抵抗的情況。

2.8 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠腸道菌群的影響

Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)通常用來表示樣本中含有的物種數(shù)目，值越大，表示物種的豐富度越高。如圖7所示，高脂飲食和STZ造模后，與空白組相比，模型組小鼠糞便菌群α多樣性未發(fā)生明顯變化，有趣的是，藥物組對(duì)小鼠腸道菌群的多樣性也并無影響，而兩歧雙歧桿菌灌胃處理后，均提高了糞便菌群物種豐富度，其中以BB1灌菌組效果最明顯(P<0.05)。主坐標(biāo)分析(prinapal co-ordinates analysis，PCoA)結(jié)果顯示，高脂飲食和STZ使得糖尿病小鼠的腸道微生物組成發(fā)生了明顯的改變，兩歧雙歧桿菌處理后，小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)不同程度的改善。藥物組雖然未能改善腸道菌群的多樣性，但藥物組小鼠的腸道菌群β多樣性與空白組最為相近。

表5 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠糞便SCFAs的影響 單位：pmol/mg

a-chao1指數(shù);b-observed species;c-PCA圖圖7 不同兩歧雙歧桿菌對(duì)小鼠腸道菌群多樣性的影響Fig.7 Effect of different Bifidobacterium bifidum on intestinal flora diversity in T2D mice

小鼠的腸道微生物主要由4個(gè)門組成，包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門。由圖8可知，與空白組相比，模型組小鼠腸道微生物組成發(fā)生了顯著變化，在門水平上，模型組小鼠腸道微生物中厚壁菌門豐度增加，擬桿菌門豐度下降，且厚壁菌門和擬桿菌門的比值顯著高于空白組，PASCALE等研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門比值的上升與低度炎癥有關(guān)[27]，我們也在糖尿病小鼠的肝臟中發(fā)現(xiàn)IL-1β和TNF-α水平上升，這和前人的研究結(jié)果是一致的。BB1、H35菌處理后，緩解了這兩種門的失調(diào)，厚壁菌門的豐度降低，擬桿菌門豐度升高，兩者比值下調(diào)，尤其是BB1菌株組，顯著改善了糖尿病小鼠腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象，這些差異與其降低血糖、改善糖尿病的表型相一致。進(jìn)一步對(duì)腸道菌群深入分析發(fā)現(xiàn)(圖9)，相比于空白組小鼠，模型組未處理的糖尿病小鼠腸道菌群中Bacteroidales、BacteroidalesS24-7、Bifidob-acterium顯著減少(P<0.05)，羅格列酮和兩歧雙歧桿菌灌胃處理后，均在不同程度上緩解了Bacteroidales、BacteroidalesS24-7的變化，其中藥物組和BB1灌菌組緩解效果更明顯。3株兩歧雙歧桿菌桿菌均顯著提高了Bifidobacterium屬的水平。之前也有研究報(bào)道，BacteroidalesS24-7是腸道內(nèi)的短鏈脂肪酸生產(chǎn)者[28]，且Bifidobacterium的豐度也與腸道內(nèi)SCFAs的含量呈正相關(guān)[29]，由此可以推測，兩歧雙歧桿菌BB1可能在腸道內(nèi)有較好的定植能力，這有助于其產(chǎn)生更多SCFAs并且對(duì)腸道菌群產(chǎn)生更大的影響，尤其是可以通過提高產(chǎn)短鏈脂肪酸菌群的豐度進(jìn)而改善T2D。

圖8 不同雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠腸道菌群門水平的影響Fig.8 Effect of different Bifidobacterium bifidum on gutmicrobial community at the phylum level in T2D mice

a-Bacteroldales豐度；b-Bacteroidales S24-7豐度；c-Bifidobacterium豐度圖9 不同雙歧桿菌對(duì)T2D小鼠腸道菌群目和科屬水平的影響Fig.9 Effect of different Bifidobacterium bifidum on gut microbial community at the order and family genus level in T2D mice

3 結(jié)論

BB1和H35這2株兩歧雙歧桿菌均能在一定的程度上發(fā)揮預(yù)防空腹血糖升高的作用，但隨著T2D病情的發(fā)展，H35降低空腹血糖的作用逐漸消失，且3株兩歧雙歧桿菌在緩解空腹血糖、HbA1c、胰島素抵抗情況、血脂情況(HDL-C)、炎癥情況(IL-1β、TNF-α)和調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸和腸道菌群失調(diào)等方面呈現(xiàn)出明顯的差異。值得一提的是，與兩歧雙歧桿菌BB13和H35相比，BB1對(duì)高脂飲食和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的T2D小鼠的血糖不耐受、血脂代謝異常和免疫功能均有明顯的改善作用。灌胃兩歧雙歧桿菌BB1后，小鼠糞便中丁酸含量顯著提高，且腸道菌群分析結(jié)果顯示，BB1顯著改善了T2D導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)，推測其緩解T2D的可能途徑是BB1緩解由高脂飲食和STZ導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)，其中增加了產(chǎn)短鏈脂肪酸(尤其是丁酸)的BacteroidalesS24-7的豐度，短鏈脂肪酸含量升高，進(jìn)一步緩解了小鼠體內(nèi)的低度炎癥，從而改善胰島素抵抗，緩解了T2D。