叢珊滋，程磊，田康明，李夢(mèng)迪，路福平*，王正祥*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457) 2(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津，300457)

芳香酯是天然存在于植物中的短鏈酯，賦予植物及其衍生產(chǎn)品宜人風(fēng)味，主要包括乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯和丁酸丁酯[1]。芳香酯也是食品、飲料、日化和制藥工業(yè)等產(chǎn)品中的常用外加風(fēng)味物質(zhì)[2]。

目前，芳香酯多從自然資源中提取或由化學(xué)法合成制得[3]。前者收得率低、生產(chǎn)成本高且受氣候和農(nóng)業(yè)條件影響顯著[4]；后者是目前芳香酯制備的主要方法，但環(huán)境不友好、產(chǎn)物分離純化復(fù)雜、碳排放量高[2,5]。某些特殊類別的脂肪酶在非天然催化條件下對(duì)芳香酯的合成作用已被廣泛研究[6-8]，這些脂肪酶也被應(yīng)用于發(fā)酵食品、飲料的加工過(guò)程，以改善產(chǎn)品風(fēng)味[9-11]。開發(fā)具有芳香酯合成能力的脂肪酶，對(duì)研究芳香酯酶法合成新技術(shù)及其在發(fā)酵食品、飲料生產(chǎn)中的應(yīng)用具有極其重要的意義[12]。

為此，本文在分析黑曲霉基因組脂肪酶生物信息的基礎(chǔ)上，對(duì)其中一個(gè)功能未知的脂肪酶進(jìn)行基因克隆和表達(dá)，并就其酶學(xué)性質(zhì)特別是芳香酯合成能力進(jìn)行解析。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉(Aspergillusniger)F0215、大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115和質(zhì)粒pPIC9k,均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶和PyrobestTMDNA聚合酶,購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒和DNA純化試劑盒,由北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司提供;真菌RNA快速提取試劑盒、cDNA合成試劑盒和G418,為Invitrogen公司產(chǎn)品;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;對(duì)硝基苯酚羧酸酯(C2～C16),購(gòu)自Sigma公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 基因克隆和表達(dá)

基因擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化與鑒定等，按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行[13]；黑曲霉總RNA的提取與cDNA制備，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行；基因擴(kuò)增采用的寡核苷酸引物，由上海生工生物工程公司合成；其序列為：上游引物：5′-gtaGCCCCCACCGCCACCCAC-3′，下游引物：5′-tgctctagaCTAAGAAGAAGAAACCCCCGCAGCCTG-3′(下劃線部分為限制性酶切位點(diǎn))。所克隆的脂肪酶基因按照常規(guī)方法，在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)[14]。在250 mL三角瓶中通過(guò)甲醇誘導(dǎo)制備發(fā)酵酶液。發(fā)酵結(jié)束后，離心取發(fā)酵液上清獲得粗酶液；用30%～60%的(NH4)2SO4分級(jí)沉淀，再用PD-10脫鹽柱(GE公司產(chǎn)品)進(jìn)行脫鹽，冷凍干燥后備用。蛋白質(zhì)濃度采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.4 脂肪酶酶活力測(cè)定與酶學(xué)特征分析

1.4.1 脂肪酶的活力測(cè)定

脂肪酶活力測(cè)定按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[15]。500 μL反應(yīng)體系中包括400 μL、50 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液、50 μL、20 mmol/L、p-NPB和50 μL酶液，30℃下反應(yīng)10 min，500 μL無(wú)水乙醇終止反應(yīng)，410 nm下測(cè)定吸光值。酶活力定義為：在一定溫度和pH下，每分鐘催化對(duì)硝基苯丁酸酯水解生成1 μmol對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.4.2 最適作用溫度和最適作用pH

在不同溫度(20～70℃)和不同pH下(pH 4.0～10.0)，按照1.4.1中的方法進(jìn)行脂肪酶活力的測(cè)定，以最高酶活為100%計(jì)算相對(duì)酶活。

1.4.3 熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

將酶液分別置于不同溫度(20～60℃)和不同pH(pH 4.0～10.0)下，放置不同時(shí)間，然后在酶的最適作用條件下，測(cè)定殘余酶活，以未經(jīng)處理的酶液活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。所用緩沖液為：20 mmol/L醋酸鹽緩沖液(pH 4.0～5.5)、20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0～7.5)、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0～9.0)和20 mmol/L甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 9.5～10.0)。

1.4.4 金屬離子、螯合劑和有機(jī)溶劑對(duì)酶活的影響

在反應(yīng)體系中分別加入1 mmol/L的金屬離子或螯合劑，室溫放置2 h，按照上述方法測(cè)定酶活，以未做添加的酶液活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。40 μL酶液和10 μL有機(jī)溶劑混合，室溫下150 r/min振蕩2 h，按照酶活測(cè)定方法測(cè)定殘余酶活力，以未做添加的酶液活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.5 底物特異性分析和動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

分別以5種不同碳鏈長(zhǎng)度的對(duì)硝基苯酚羧酸酯(C2、C4、C8、C12、C16)為底物，測(cè)定脂肪酶的酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。用異丙醇配制一系列不同濃度的底物，測(cè)定脂肪酶在不同底物濃度下的酶活力，以底物濃度的倒數(shù)(1/[S])為橫坐標(biāo)、反應(yīng)速率的倒數(shù)1/V為縱坐標(biāo)作圖，并利用公式(1)計(jì)算Km和Vmax的值[16]：

(1)

1.6 芳香酯合成

芳香酯(辛酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸丁酯)的酶法合成，按照文獻(xiàn)[6-8]的方法，在30 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)12 h。其中，辛酸乙酯合成體系為：0.6 mol/L辛酸、0.72 mol/L乙醇和100 U/mL重組酶，溶劑為正庚烷；乳酸乙酯合成體系為：1.17 mol/L乳酸、4.68 mol/L乙醇和50 U/mL重組酶，溶劑為叔丁醇；丁酸丁酯合成體系為：0.1 mol/L丁酸、0.2 mol/L丁醇和20 U/mL重組酶，溶劑為正己烷。反應(yīng)結(jié)束后以12 000 r/min離心2 min，取上清進(jìn)行產(chǎn)物分析。

芳香酯組成與含量用氣相色譜法分析[17]，色譜條件為：毛細(xì)管柱HP-INNOWax(30 m×0.32 mm×0.5 μm)，檢測(cè)器為FID；進(jìn)樣口溫度200℃，檢測(cè)器溫度250℃，H2流量40 mL/min，空氣流量300 mL/min，尾吹流量25 mL/min；進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1；載氣為氮?dú)猓魉?.8 mL/min；起始柱溫50℃，保持8 min，以5 ℃/min的速度上升至200 ℃，保持5 min。

1.7 生物信息學(xué)分析

A.nigerCBS 513.88基因組序列信息(EMBL AM270980-AM270998),來(lái)自GenBank；脂肪酶序列比對(duì)，用Clustal X2程序進(jìn)行；信號(hào)肽分析,采用SignalP 4.1軟件進(jìn)行在線分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉脂肪酶CutA的基因克隆與表達(dá)

對(duì)A.nigerCBS 513.88基因組序列中疑似脂肪酶開放讀框進(jìn)行分析，獲得了一個(gè)功能未知的脂肪酶開放讀框cutA，大小為0.8 kb，編碼289個(gè)氨基酸殘基，含有由16個(gè)氨基酸殘基組成的典型信號(hào)肽序列。以A.nigerF0215 cDNA為模板，對(duì)其成熟肽編碼序列進(jìn)行擴(kuò)增并克隆入表達(dá)載體pPIC9K中，獲得重組質(zhì)粒pPIC-cutA；經(jīng)核苷酸序列測(cè)定與分析后發(fā)現(xiàn)，所克隆的cutA核苷酸序列與A.nigerCBS 513.88中相應(yīng)序列存在5個(gè)堿基差異，但氨基酸序列完全一致。

將線性化的重組質(zhì)粒pPIC-cutA轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115，經(jīng)篩選與鑒定后獲得cutA重組菌，命名為ANL-CutA。經(jīng)搖瓶發(fā)酵，重組菌ANL-CutA的發(fā)酵上清中含有7.52 U/mL的脂肪酶酶活。通過(guò)30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))(NH4)2SO4去除雜蛋白，再繼續(xù)添加(NH4)2SO4至飽和度為60%沉淀目的蛋白CutA，目的蛋白用磷酸鹽緩沖液復(fù)溶并檢測(cè)酶活及蛋白濃度，純化后CutA的比酶活為46.28 U/mg。重組CutA在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶(圖1)，分子質(zhì)量約為27 ku，與理論分子質(zhì)量大小相符。

M-蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-GS115發(fā)酵液；2-ANL-CutA發(fā)酵液；3-純化后的重組CutA圖1 重組CutA的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE profile of the recombinant CutA

2.2 重組CutA的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適作用溫度和熱穩(wěn)定性

在不同溫度下檢測(cè)CutA的脂肪酶活力，結(jié)果顯示，CutA的最適作用溫度為30℃(圖2-a)；當(dāng)溫度降至20℃時(shí)相對(duì)酶活僅為30%，當(dāng)溫度高至60℃時(shí)酶活接近喪失(圖2-a)。重組酶在低于40℃下孵育4 h，殘余酶活均在60%以上，穩(wěn)定性良好；隨著溫度的上升，酶活力穩(wěn)定性明顯下降(圖2-b)。

a-最適作用溫度；b-熱穩(wěn)定性圖2 溫度對(duì)CutA活力和穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity and stability of CutA

2.2.2 最適作用pH和pH穩(wěn)定性

在不同pH下檢測(cè)CutA的活力，結(jié)果顯示，CutA的最適作用pH為7.0，在pH 6.5～8.0酶活保持在60%以上(圖3-a)。重組酶在不同pH下孵育4 h，在pH為6.0～8.0的緩沖體系下殘余酶活在60%以上，在接近中性pH范圍內(nèi)，CutA穩(wěn)定性良好(圖3-b)。

a-最適作用pH；b-pH穩(wěn)定性圖3 pH值對(duì)CutA活力和穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of pH on the activity and stability of CutA

2.2.3 金屬離子和螯合劑對(duì)重組脂肪酶活力的影響

在反應(yīng)體系中加入1 mmol/L的金屬離子或螯合劑，研究金屬離子或螯合劑對(duì)CutA酶活的影響，結(jié)果匯總于表1。所檢測(cè)的金屬離子和化學(xué)品對(duì)此酶皆有不同程度的抑制作用，以Fe3+對(duì)CutA抑制作用最為顯著。

表1 金屬離子及螯合劑對(duì)CutA活力的影響Table 1 Effects of metal ions and chelate agent on the activities of CutA

2.2.4 重組酶有機(jī)溶劑耐受性

研究了不同有機(jī)溶劑對(duì)重組酶活力的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，叔丁醇和庚烷對(duì)CutA活力幾乎無(wú)影響；乙醇、氯仿、正己烷、正辛烷、二甲基亞砜和甲苯有一定抑制作用；二氯甲烷和丙三醇的抑制作用最為顯著。

圖4 有機(jī)溶劑對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.4 Effect of organic solvents on the activity of CutA

2.3 重組脂肪酶底物特異性

以不同鏈長(zhǎng)的對(duì)硝基苯酚酯為底物，對(duì)重組CutA的水解特征進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。CutA的最適作用底物為C2，其次依次為C4、C8和C12，對(duì)C16無(wú)水解作用。CutA對(duì)不同鏈長(zhǎng)底物呈現(xiàn)出不同的水解活性，偏好于對(duì)短鏈脂肪酸酯的水解。以對(duì)硝基苯酚乙酯為底物，CutA的Km值為19.5 mmol/L，Vmax為63.3 mmol/(mL·h)。

2.4 CutA具有酯化活性

以重組CutA為催化劑，進(jìn)行了3種常見芳香酯的酶促合成，結(jié)果如圖6所示。CutA可催化合成丁酸丁酯、乳酸乙酯和辛酸乙酯，合成丁酸丁酯、乳酸乙酯和辛酸乙酯的轉(zhuǎn)化率分別為17.2%、4.7%和1.8%。實(shí)驗(yàn)條件下，CutA更傾向于丁酸丁酯的酶促合成；對(duì)乳酸乙酯和辛酸乙酯的合成能力次之。

圖5 CutA的底物特異性Fig.5 The substrate specificity of CutA

a-CutA催化丁酸和丁醇反應(yīng)；b-CutA催化乳酸和乙醇反應(yīng)；c-CutA催化辛酸和乙醇反應(yīng)S-標(biāo)準(zhǔn)品；R-反應(yīng)組；C-對(duì)照組圖6 CutA催化合成芳香酯的氣相譜圖Fig.6 GC profiles of of butyl butyrate, ethyl caprylate and ethyl lactate synthesized by CutA

3 結(jié)論與討論

芳香酯廣泛來(lái)源于植物，也存在于常見發(fā)酵食品、飲料。辛酸乙酯是濃香型白酒中僅次于己酸乙酯的重要風(fēng)味成分[18]。乳酸乙酯對(duì)減少白酒酒體刺激感、增加醇甜感和厚度、延長(zhǎng)后味有顯著作用[19]；在酸菜自然發(fā)酵中后期，是揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中含量最高的組分[20]。丁酸丁酯見于白酒、奶酪、火腿等風(fēng)味成分的報(bào)道[21-23]。

酶制劑在食品風(fēng)味增強(qiáng)與改善中的應(yīng)用已得到廣泛研究。吳華昌等在白酒陳化中分別使用不同種類的脂肪酶，其中一種可加速白酒中酸、酯、醇平衡[9]。封莉等以脂肪酶促進(jìn)中式香腸中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的生成，適量添加可顯著提高香腸香氣[10]。張碩等在奶酪中添加脂肪酶，奶酪中酯、酸等揮發(fā)性物質(zhì)增加，奶酪風(fēng)味得到改善[11]。

本研究首次報(bào)道了黑曲霉脂肪酶CutA具有合成乳酸乙酯、辛酸乙酯和丁酸丁酯的酯化活性，為芳香酯形成或合成提供了新的可能性，CutA的酯化活性在食品加工和釀造方面具有一定的應(yīng)用潛力。