李德保，周 莉，孫祖越

(1.上海市計劃生育科學研究所，中國生育調節(jié)藥物毒理檢測中心，上海 200032； 2.復旦大學藥學院，上海 201203；3.國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室，上海 200032；4.復旦大學生殖與發(fā)育研究院，上海 200032)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是醫(yī)學上應用很久的經典名詞，其定義為女性在40歲之前就發(fā)生4～6個月的閉經，同時伴隨卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)水平升高(FSH>40 U/L)而雌二醇水平降低。然而，POF只能代表卵巢功能衰竭的終末階段，不能很好涵蓋該疾病漫長而多變的臨床過程。因此，2008年美國生殖醫(yī)學學會(American Society for Reproductive Medicine，ASRM)正式采用“原發(fā)性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency)”的概念[1]，但由于原發(fā)性一般是針對繼發(fā)性而言，這里的“原發(fā)性”已不是原意，引起了諸多困惑。2016年，歐洲人類生殖與胚胎學會(European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE)發(fā)表了最新的《POI處理指南》，將POI全稱更改為早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)，且將FSH的診斷閾值(40 U/L)降為25 U/L，旨在更早發(fā)現POI女性，達到早診斷、早治療的目的[2]。2016年12月中華醫(yī)學會婦產科學分會絕經學組發(fā)表的《早發(fā)性卵巢功能不全的激素補充治療專家共識》中[3]，國內相關專家將早發(fā)性卵巢功能不全定義為女性在40歲之前卵巢活動衰退的臨床綜合征，以月經紊亂(如停經或稀發(fā)月經)伴有高促性腺激素和低雌激素為特征。

任何階段的POI歸根到底都可能是由于原始卵泡數量減少、細胞凋亡或卵泡破壞增加、卵泡對促性腺激素刺激的無效反應所致[1]。目前的研究中，已經明確的病因有性染色體結構異?；蚰承┏Ｈ旧w基因缺陷、自身免疫性卵巢損傷、感染因素和醫(yī)源性因素等，然而，仍有50%以上的POI病因不明[4]。了解與POI相關的信號轉導通路對闡釋POI的發(fā)病原因、恢復卵巢功能與尋找潛在的藥物治療靶點和診療新技術具有重要的意義。本文綜述了與POI相關的信號通路研究進展。

1 TGF-β及其家族成員信號通路

1.1 TGF-β信號通路

轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是轉化生長因子超家族中的一類多功能細胞因子，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3等多種亞型。一般直接參與信號轉導的TGF-β受體由Ⅰ型和Ⅱ型受體亞單位組成，激活的TGF-β復合物與其他因子形成絲氨酸/蘇氨酸激酶復合物，進而與TGF-β受體結合。與受體結合后，Ⅱ型受體激酶磷酸化并激活Ⅰ型受體激酶實現級聯信號轉導。這導致不同下游底物和調節(jié)蛋白的激活，誘導不同功能靶基因的轉錄[5]。TGF-β信號通路主要可以分為兩類，一類由Smad(drosophila mothers against decapentaplegic protein)蛋白介導，稱為經典通路。在此情況下，受體激活的Smad被Ⅰ型TGF-β受體激酶磷酸化，并與其他Smad蛋白形成復合物，后者能夠轉移到細胞核，從而誘導不同效應器的轉錄。還有一類是非Smad蛋白介導的信號通路，如通過激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路傳導信號[6]。

TGF-β有多種生物學功能，參與生殖細胞的增殖分化和胚胎形成是其中重要的一部分，因此有學者對TGF-β信號通路在POI中的作用進行了探索。Mantawy等[7]在研究放射性治療導致的POI時，發(fā)現Chrysin(5,7-二羥基黃酮)可以通過恢復雌二醇水平、維持正常卵巢組織結構和對抗濾泡丟失來預防POI。進一步研究發(fā)現，Chrysin對TGF-β信號通路和下游MAPK級聯的抑制作用可能是其治療放療誘導的POI的機制。Zhang等[8]在研究人羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cells，HAECs)對化療藥物導致的POI的治療作用時發(fā)現，在與HAECs共培養(yǎng)的顆粒細胞中不僅檢測到高濃度的TGF-β1，同時磷酸化的Smad2和Smad3蛋白表達量也明顯高于未經治療的化療藥物處理組，HAECs可以激活顆粒細胞內的TGF-β/Smad信號通路。由此可以看出，在不同的POI中，TGF-β含量的變化也不盡相同甚至相反，單純檢測TGF-β含量的變化是遠遠不夠的，應該結合病理診斷結果，進一步探究其上下游信號分子，從而明確激活或者抑制的信號通路以及由此產生的效應。

1.2 TGF-β超家族其他成員信號通路

TGF-β超家族是一大類結構相關的細胞因子，主要包括TGF-β亞家族、骨形態(tài)發(fā)生蛋白與生長分化因子、激活素和抑制素亞家族等。除TGF-β外，還有一些家族成員介導的信號通路與POI有很強的相關性，在此一并介紹。

1.2.1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)

BMP由Urist在1965年首次在成人骨組織中發(fā)現，并在之后的研究中被確定為TGF-β超家族中的亞家族(BMp-1除外)。利用基因敲除的小鼠，研究人員證明BMP亞家族成員BMp-15與POI密切相關[9]。此外，越來越多的臨床案例[10]表明，BMp-15的基因突變導致人類產生POI，且在人類中自然發(fā)生的BMp-15突變產生的后果比在小鼠中更為嚴重，這可能與排卵和月經周期的差異有關[11]。利用大鼠原代顆粒細胞和人顆粒細胞細胞系COV434，Moore等[12]發(fā)現給予BMp-15可引起Smad1/5/8途徑的快速和短暫磷酸化，從而激活Smad1/5/8途徑。但在早期非洲爪蟾胚胎發(fā)生過程[11]中，發(fā)現BMp-15作為Smad1/5/8通路和Wnt通路的抑制劑發(fā)揮作用，BMp-15強烈抑制BMp-4誘導的BMP響應信號反應，阻斷Smad1/5/8 MH2結構域的磷酸化和活化。

上述實驗結果表明，在生殖發(fā)育過程中，BMp-15有時可能是激動劑的作用，有時也可能發(fā)揮抑制作用。實際上，當BMp-15抑制一種誘導物，如BMp-4時，Smad1/5/8信號通路被抑制；然而，如果BMp-15抑制另一種抑制物，將可能導致Smad1/5/8通路的激活?？赡艿慕忉屖?，不同的物種以及卵泡發(fā)育的不同時空，將會導致不同的信號閾值和信號時長，從而產生不同的調節(jié)效應，這充分說明了BMP調控的精確性和復雜性。此外，大多數BMP成員，如BMp-2、BMp-4、BMp-6和BMp-7，已經被證明在許多不同的細胞類型中激活了Smad信號通路發(fā)揮作用。

1.2.2 生長分化因子(growth differentiation factor，GDF)

在GDF亞家族中，與POI最密切也是最受關注的是GDF-9，GDF-9基因位于5號染色體的長臂上，研究發(fā)現GDF-9 mRNA僅在卵巢中高水平表達[13]，GDF-9的這種高選擇性表達提示了其在卵巢中獨特而重要的作用。已經有多項研究表明，在一些POI患者中，GDF-9基因位點的突變是主要的病因。另外，GDF-9的特殊性還在于有充分的證據表明GDF-9和BMp-15在遺傳、生化和功能水平上存在協同作用[14]。與POI相關的BMp-15突變可降低其與GDF-9的協同作用，從而從另一個角度闡釋了POI產生的原因[15]。通常，GDF-9 與受體間變性淋巴瘤激酶-5(anaplastic lymphoma kinase，ALK5)和II型BMP受體(BMPRII)結合后，誘導Smad2/3磷酸化，從而激活Smad2/3信號通路[16]，而BMp-15一般是結合受體BMPRII和ALK6并隨后激活Smad 1/5/8信號通路；現在發(fā)現，BMp-15和GDF-9也可以通過形成異二聚體，與受體BMPRII-ALK4/5/7-ALK6復合物結合，激活Smad 2/3信號通路[17]。

1.2.3 激活素、抑制素、抗苗勒氏管激素

除上述之外，TGF-β超家族中的其他成員，如激活素(activin)、抑制素(inhibin)和抗苗勒氏管激素(anti-müllerian hormone，AMH)等，與某些特發(fā)性POI的形成也有一定的關系。激活素促進垂體前葉釋放FSH，并在生殖生物學、胚胎發(fā)育以及炎癥和纖維化的控制中發(fā)揮多方面的作用[18]；與之相對的，抑制素則是作為垂體FSH合成的負性調節(jié)劑或作為旁分泌因子在調節(jié)卵巢功能中發(fā)揮作用[19]；AMH則與功能性卵巢儲備相關，因此在POI中常被用作診斷和預后標志物[20]。激活素結合到激活素Ⅱ型受體(ActRII或ActRIIB)上，使這些Ⅱ型受體磷酸化激活素I型受體(ActRIB)進而激活ALK4，活化的ALK4磷酸化細胞內信號蛋白Smad2/3，從而使Smad2/3蛋白與Smad4蛋白結合形成復合物，進而轉移到細胞核而發(fā)揮效應[21]。盡管激活素信號轉導途徑已被廣泛認知，但抑制素信號轉導機制仍然是一個活躍的研究領域，暫沒有完整的論述。AMH也有其被報道的通路，即AMH通?？梢酝ㄟ^與Ⅰ型受體ALK2/ALK3或Ⅱ型受體(MISRII)結合，從而激活Smad 1/5/8信號通路[22]。

TGF-β超家族相關的信號通路與POI的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系，為POI發(fā)病原因的闡釋以及POI未來治療方向提供了一定的參考。同時由于TGF-β超家族成員眾多、信號調控網絡精確而復雜，仍有許多地方值得作進一步探討，如信號轉導通路與POI關聯性的強度以及治療靶點的鑒定與篩選。目前的研究更多的是關注于篩選和報道更多POI相關基因，在利用這些發(fā)現探索內在的分子機制上還做得比較少。這其中，尤其值得注意的是BMp-15，在遺傳因素導致POI的患者中，BMp-15缺陷占比較高，僅次于FMR1基因缺陷[19,23]。

2 PI3K-AKT和Hippo信號通路

磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號通路是體內的基礎信號通路，現在發(fā)現其不僅在調控腫瘤中具有重要作用，對卵巢休眠和初始卵泡激活也有重要意義。Hippo信號通路雖然是新興的信號通路，但已經顯示出該通路復雜多變，與其他信號通路存在諸多交聯且參與調控卵泡發(fā)育。近年來，原始卵泡體外激活(in vitro activation of primordial follicles，IVA)為POI患者恢復生育能力提供了一種新的技術，而IVA便是基于PI3K-AKT信號通路和Hippo信號通路而開發(fā)的[24]。2013年Kazuliro等[25]首次提出該項技術并應用到臨床，使POI患者成功妊娠并產下健康嬰兒，展示出其重大的應用價值。

2.1 PI3K-AKT信號通路

對于PI3K-AKT信號通路，激活或抑制的AKT可以影響眾多下游信號分子，研究較多并與POI相關性較大的為FoxO信號通路和mTOR信號通路，在此分別敘述。

2.1.1 PTEN/PI3K/AKT/FoxO3信號通路

磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)是PI3K/AKT信號通路的負調控因子，利用基因分析工具誘導切除成人卵母細胞中的PTEN，會導致AKT過度活化、叉頭轉錄因子O3(forkhead transcription factor O3，FoxO3)過度磷酸化和FoxO3核輸出，最終導致原始卵泡過度活化和POI[26]。而FoxO3缺陷小鼠表現出原始卵泡的全身激活，導致卵巢增生、卵泡耗盡、POI和不孕[27]。卵母細胞特異性切除PTEN和FoxO3導致了幾乎完全相同的初始卵泡激活表型。進一步的研究表明，PI3K抑制劑抑制了PTEN基因敲除的卵巢表型，而不是FoxO3基因敲除的卵巢表型，表明FoxO3位于PTEN下游。對于卵泡激活，FoxO3是PI3K/AKT通路的主要效應器，而PTEN在卵母細胞內的基本作用就是調節(jié)FoxO3[26]。這些結果提示PTEN/PI3K/AKT/FoxO3通路的負調控可能導致卵泡激活延遲和原始卵泡閉鎖，而PTEN的抑制和PI3K的激活可能導致休眠卵泡的激活。有趣的是，往往是由于PTEN/PI3K/AKT/FoxO3信號通路的過度激活導致POI的產生，但激活此通路又可以為不孕的POI患者帶來治療希望。這其實也表明了IVA技術的局限性，即無法對卵泡被完全耗盡而無休眠卵泡的POI患者應用此技術。

卵泡顆粒細胞具有廣泛的能量生成和自由基清除功能，可能與POI有關，Ernst等[28]發(fā)現參與氧化防御的蛋白可能通過PI3K/PTEN/AKT信號通路調節(jié)初級卵泡顆粒細胞中的卵泡生長，通過抑制因子PTEN的負調節(jié)器發(fā)揮作用。Chang等[29]發(fā)現順鉑治療降低了PTEN水平，使得PTEN/AKT/FoxO3途徑被激活，增加了卵泡中FoxO3的胞質轉運，迅速耗盡了休眠卵泡的數量，從而導致POI的產生。

2.1.2 PI3K/AKT/mTOR信號通路

哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其有兩種復合體，分別為mTORC1和mTORC2。mTOR抑制基因Tsc1或Tsc2介導的mTORC1活性的抑制對維持卵泡池是必不可少的，且卵母細胞中mTORC1活性的增加會使原始卵泡池被提前激活，從而導致卵泡提前衰竭，產生POI[30]。人卵巢片段短期暴露于AKT刺激劑(PTEN抑制劑和PI3K激活劑)可促進卵泡生長，與mTOR激活劑聯合治療，可以進一步提高卵泡激活的成功率[31]。

臨床上，電針療法有時候會被推薦為POI的補充治療手段，為了探究其內在的機制， Zhang等[32]對POI小鼠做了探究，發(fā)現PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響可能是起效的機制之一。類似的，有學者研究針刺治療POI，發(fā)現治療效果與雌激素治療效果相當，作用機制可能與上調PI3K/AKT/mTOR信號通路相關基因和蛋白表達水平有關[33]。Li等[34]發(fā)現白藜蘆醇通過激活雷公藤多苷誘導的大鼠POI模型中的PI3K/AKT/mTOR信號通路，減輕氧化應激，抑制顆粒細胞凋亡。利用攜帶人類FMR1前突變等位基因的小鼠模型，Lu等[35]發(fā)現FMR1前突變RNA可引起與FMR1前突變攜帶者相關的POI，進一步研究發(fā)現AKT和mTOR蛋白的磷酸化均降低，AKT/mTOR途徑或許可作為此類POI的治療靶點。有趣的是，與其他的報道不同，在這里，FMR1前突變使得AKT和mTOR蛋白的磷酸化均降低。因此，采用mTOR抑制劑的治療方式，或許并不適用于某些遺傳因素導致的POI。

值得注意的是，除了AKT外，mTOR還可以接受各種來自細胞內和細胞外的信號刺激，因此，其他信號刺激引起的mTOR信號通路的激活同樣有可能與POI產生有關，如mTOR抑制基因Tsc的缺失。同時，就像Tsc和PTEN的雙重缺失導致了原始卵泡激活的協同增強一樣，PI3K/AKT/mTOR信號通路和其他信號刺激激活的mTOR信號通路在調節(jié)原始卵泡休眠中可能存在協同作用。

2.1.3 其他

最近的研究表明，PI3K/AKT信號通路途徑在免疫和自身免疫中也起著關鍵作用[36]，人胎盤源性間充質干細胞(human placenta-derived mesenchymal stem cell，hPMSC)移植已被證明是一種恢復自身免疫性POI小鼠卵巢功能的有效方法，Yin等[37]的數據表明，PI3K/AKT信號通路通過改變POI小鼠hPMSC移植后輔助性T 細胞17(T helper cell 17, Th17)/細胞毒性T細胞17(cytotoxic T cell 17，Tc17)和Th17/調節(jié)性T細胞(regulatory cell，Treg)細胞的比率參與卵巢功能的恢復，這也提示了PI3K/AKT信號通路在治療自身免疫性POI上的潛力。

此外，半乳糖血癥是一種常染色體隱性疾病，由編碼半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶的GALT基因有害突變引起，盡管限制患者半乳糖飲食，但大多數典型半乳糖血癥的女性會患有POI[38]。研究發(fā)現，GALT缺陷小鼠的內質網應激水平較高，并且PI3K/AKT信號通路下調。而沙丁醛(一種可以減輕內質網應激的物質)能有效地逆轉突變細胞和動物體內下調的PI3K/AKT信號通路[39]。這不僅有助于理解半乳糖血癥引發(fā)POI的原因，也為半乳糖血癥POI的治療提供了參考。

2.2 Hippo信號通路

Hippo信號通路是一個從腫瘤抑制基因Hippo(哺乳動物中為MST1和MST2)到腫瘤蛋白Yki(哺乳動物中為YAP和TAZ)的激酶級聯信號通路。Hippo信號通路通過磷酸化使YAP/TAZ和其他轉錄因子失活，從而防止異常組織生長，是器官大小的調節(jié)器，在發(fā)育和再生的適當階段阻止器官生長[40]。在多囊卵巢綜合征中，雙側卵巢楔形切除術或激光打孔治療這種機械性損傷程序可以促進排卵，雖然其中的機制還不十分明了，卻對POI患者的卵泡激活是一個很好的啟發(fā)。Kazuhiro等[25]發(fā)現，將卵巢組織切割成碎塊的機械操作可以達到卵泡激活。這是因為，Hippo信號通路特異性地阻止原始卵泡的激活，將卵巢組織切割成碎片可以破壞這一途徑。具體來說，因為卵巢碎片改變了細胞間的張力，促進肌動蛋白聚合，該聚合過程破壞卵巢Hippo信號傳導，導致下游生長因子表達增加，促進卵泡生長，并產生成熟卵母細胞[24]。目前除了卵泡激活，Hippo信號通路在POI中的研究還比較少，僅有少量報道顯示其可能是中藥或天然產物作用機制的一部分。如Xie等[41]證明Huyang yangkun方通過Hippo-JAK2/STAT3信號途徑修復POI大鼠的功能紊亂，增強POI大鼠的卵巢功能。Ai等[42]發(fā)現雷公藤多苷通過誘導內源性miR-15a表達和抑制Hippo-YAP/TAZ途徑，促進卵巢顆粒細胞的細胞毒性、衰老和凋亡。

3 其他信號通路

除此之外，還有眾多的信號通路在POI的發(fā)生發(fā)展和治療中有一定的意義。如Wnt/β-catenin(βn連環(huán)蛋白，β環(huán)蛋白，-cat)信號通路與POI相關性較高，同時與PI3K-AKT信號通路存在交聯。Rspo2雜合子缺陷雌性小鼠在4個月齡左右變得不育，類似于POI，而Rspo2則是典型Wnt/β-catenin信號通路的激動劑，體現了該通路與POI的相關性[43]。石斛多糖[44]、白藜蘆醇[45]等天然產物一定程度上可以減輕POI損傷，這其中有核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路的參與，該通路與諸多細胞炎癥因子相關。Notch受體信號通路參與調控生殖細胞減數分裂過程，Liu等[46]發(fā)現在臨床前試驗中曾被用于治療POI的生長激素可通過激活卵巢組織中的Notch-1信號通路促進卵巢組織修復、雌激素釋放和卵母細胞成熟。此外，像MAPK信號通路、NO/cGMP信號通路和p53信號通路等，由于這些通路在卵泡發(fā)育、減數分裂、氧化應激、細胞凋亡等過程中發(fā)揮一定的作用，與POI均有不同程度的聯系。

4 小結

總而言之，與POI相關的信號通路眾多，不同病因導致的POI所關聯的信號通路也不盡相同。值得一提的是，從信號轉導通路上來看，遺傳因素導致的POI與其他因素所致POI在機制上有較大的區(qū)別，如前文所述，非遺傳因素導致的POI基本都是過度激活了PI3K/AKT信號通路，但FMR1前突變使得AKT和mTOR蛋白的磷酸化均降低，GALT基因有害突變使PI3K/AKT信號通路下調。由于大部分POI具有特發(fā)性的特點，對于不同的患者，信號通路在其中的調控也有不同，因此不僅需要深入探究信號通路調控的方式，也對進一步加深理解POI疾病本身提出了要求。對相關信號通路的深入理解，有望為治療POI打開新的思路。