周 琪 (成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 611137)

癌基因受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1,ROR1) 是受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTKs)家族成員之一，與生長(zhǎng)因子受體的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域具有很高的同源性，低表達(dá)于胚胎發(fā)育過程中[1,2]，而高表達(dá)于多種惡性腫瘤或組織中，如慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺腺癌等[3-9]。因此，ROR1是一種在腫瘤生物學(xué)中具有新興作用的胚胎蛋白，其具有高度識(shí)別性，已成為腫瘤特異性標(biāo)志物[2]。大量數(shù)據(jù)顯示，ROR1在促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥和抑制細(xì)胞凋亡等方面起到了不可小視的作用[7,9-12]。人ROR1分子由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)包括一個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(immunoglobulin-like domain,Ig-like)、兩個(gè)富含半胱氨酸卷曲的結(jié)構(gòu)域(cysteine-rich domain or frizzled,CRD or FZD)和一個(gè)kringle(KNG)結(jié)構(gòu)域(KRD)；胞內(nèi)區(qū)，含有一個(gè)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(tyrosine kinase domain,TKD)、兩個(gè)富含絲氨酸/蘇氨酸的結(jié)構(gòu)域(serine/threonines-rich domain,Ser/ThrD)和一個(gè)富含脯氨酸富集結(jié)構(gòu)域(proline-rich domain,PRD)[2,13-15]。

近幾年，無論是雜交瘤單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)還是基因工程抗體都已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于腫瘤免疫治療中，其制備技術(shù)也已經(jīng)比較成熟[16,17]?；蚬こ炭贵w包括多種單鏈片段可變抗體(single-chain fragment variables，scFvs)、嵌合抗體(chimeric antibody)、Fab類抗體、抗體藥物偶聯(lián)物(antibody-drug conjugate，ADC)、嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T)和雙特異性抗體(bispecific antibody，BiAb)等[16,18-22]。靶向ROR1抗體已成為腫瘤免疫治療的發(fā)展趨勢(shì)，不僅具有特異性識(shí)別腫瘤抗原的特點(diǎn)，還具有高效、低毒殺死腫瘤細(xì)胞的功效。比如：靶向腫瘤ROR1胞外區(qū)Ig-like、FZD或KRD制備的抗ROR1 mAb，這些抗體能特異性地識(shí)別腫瘤抗原ROR1并與之結(jié)合，而且大部分抗體還能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]；或者靶向ROR1胞外區(qū)Ig-like的scFv可以明顯地抑制血液系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞，呈劑量遞呈性，而且這種抑制作用可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24，25]。甚至靶向ROR1胞外區(qū)Ig-like和FZD的特定位點(diǎn)制備的CAR-T能加大其抗體對(duì)ROR1的識(shí)別性，同時(shí)也能擴(kuò)大其T細(xì)胞抗腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)[26]；而且，靶向ROR1 KRD中膜近端表位的BiAb，其特異性連接的T細(xì)胞比與膜遠(yuǎn)端表位結(jié)合時(shí)其T細(xì)胞更能發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[27]；以及靶向ROR1 FZD的BiTE比靶向Ig-like的BiTE在ROR1+癌細(xì)胞株中更能產(chǎn)生持續(xù)優(yōu)越且可重復(fù)的細(xì)胞毒性等[28]。本文主要綜述靶向ROR1腫瘤免疫治療的研究進(jìn)展。

1 單克隆抗體(mAb)

Daneshman等[23]利用雜交瘤細(xì)胞制備抗體的生物學(xué)技術(shù)針對(duì)ROR1胞外段的Ig-like、CRD和KRD分別制備了五株mAb，在模擬臨床條件中，它們都能針對(duì)CLL細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生ADCC或CDC，促進(jìn)細(xì)胞快速凋亡，卻不會(huì)誘導(dǎo)正常B淋巴細(xì)胞凋亡。其中最有效的抗CRD和KNG的mAb顯著優(yōu)于已批準(zhǔn)臨床使用的CLL治療藥物利妥昔單抗(P<0.005)。此外，Cui等靶向ROR1胞外區(qū)制備多種mAb，并選擇了一種mAb D10，研究發(fā)現(xiàn)該抗體在37℃條件中可以迅速下調(diào)ROR1以及抑制體內(nèi)ROR1+乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[29]。Widhopf等[30]進(jìn)一步鑒定mAb D10時(shí)發(fā)現(xiàn)，盡管D10是一株親和力相對(duì)較低的mAb，但是其在CLL的ROR1轉(zhuǎn)基因小鼠模型中卻能明顯地抑制AKT的激活和ROR1+白血病細(xì)胞的植入。

2 單鏈片段可變抗體(scFv)

scFv是利用柔性連接肽(peptide linker)把重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因連接起來(VH-VL)[31]，其主要由噬菌體展示技術(shù)(phage display technology)制備。與mAb相比，scFv的免疫原性小，半衰期較短以及藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)具有潛在優(yōu)勢(shì)[18]。Maleki等[24]從噬菌體人類scFv庫(kù)I+J(Tomlinson I+J)中成功篩選出一種靶向ROR1胞外區(qū)Ig-like肽段的scFv。在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種新的scFv通過與ROR1特異性結(jié)合后可以對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤CLL和RPMI8226細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，呈劑量遞呈關(guān)系，而且這種抑制作用可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而，還需要進(jìn)一步的研究來評(píng)估這種scFv的體內(nèi)腫瘤抑制作用。此外，scFv與之前報(bào)道的小鼠、嵌合體和人源化的抗ROR1抗體相比，其優(yōu)點(diǎn)是體積更小，對(duì)ROR1的親和力高，成本低，且易于生產(chǎn)[25]。

3 嵌合抗體(chimeric antibody)

Widhopf等[29]基于mAb D10獨(dú)特生物活性的特性，利用mAb D10結(jié)合ROR1時(shí)映射的表位，制備出具有高親和力且可變區(qū)人源化的mAb，這種mAb被命名為cirmtuzumab或UC-961[30]。Choi等[32]在臨床前研究結(jié)果中指出，cirmtuzumab在使用過程中具備安全可靠性，因?yàn)榇篌w動(dòng)物病理檢查結(jié)果顯示正常，未見其不良反應(yīng)。以此，cirmtuzumab已經(jīng)進(jìn)入臨床第1階段試驗(yàn)。隨后，多項(xiàng)研究結(jié)果提出cirmtuzumab抗腫瘤活動(dòng)中效應(yīng)機(jī)制，例如：cirmtuzumab可以阻斷Wnt5A誘導(dǎo)的Rac1活化，增強(qiáng)ibrutinib治療CLL患者療效[33]；還可以增強(qiáng)Bcl-2抑制劑venetoclcax對(duì)ROR1+CLL細(xì)胞的細(xì)胞毒性[34]。以及通過抑制Wnt5a誘導(dǎo)的乳腺癌中Rho-GTPases、Hippo-Yap/TAZ和Bmi1的激活，阻止乳腺癌患者來源的異種移植(PDX)瘤在小鼠體內(nèi)再植入，而且還逆轉(zhuǎn)乳腺癌干細(xì)胞的耐藥性，改善乳腺癌患者化療的副反應(yīng)[35]。

4 Fab類抗體

Fab抗體是由重鏈(VH-CH1)的Fd片段和完整的輕鏈(VL-CL)結(jié)合組成，隨著基因工程抗體技術(shù)的進(jìn)步，F(xiàn)ab基因表達(dá)不斷被優(yōu)化，功效也被提高[19]。Yin等[36]以VH-CH1和VL-CL為模板，在體外構(gòu)建的一組抗ROR1嵌合Fab抗體(ROR1-cFab)，可以特異性地結(jié)合ROR1蛋白和ROR1+卵巢癌A2780細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，呈劑量依賴性。然而，ROR1-cFab卻不能抑制ROR1-卵巢癌Iose386細(xì)胞的惡性行為。隨后，以ROR1-cFab的重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區(qū)為模板，成功構(gòu)建一組抗ROR嵌合IgG抗體(ROR1-IgG)。研究結(jié)果表明，ROR1-IgG與ROR1+卵巢癌細(xì)胞(HO8910和A2780)特異性結(jié)合，在PDX瘤中能有效抑制Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Bax明顯升高，起到抗增殖與促凋亡的作用。與ROR1-cFab相比，ROR1-IgG表現(xiàn)出更高的親和力和無明顯的免疫排斥反應(yīng)，這不僅保留了Fab片段特異性抗原識(shí)別的特點(diǎn)，還執(zhí)行了抗體的其他生物學(xué)功能，如免疫調(diào)節(jié)、激活CDC或ADCC等[37]。

5 抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)

ADC是一種副作用小的新型免疫毒素。在腫瘤細(xì)胞分子水平基礎(chǔ)上，將具有生物活性的小分子藥物經(jīng)化學(xué)方法鏈接到mAb或scFv上，其抗體分子作為主要載體將小分子藥物載向目標(biāo)細(xì)胞或分子，由小分子藥物選擇性地發(fā)揮抗腫瘤的毒性作用的機(jī)制[20]。Peyman等[38]在抗ROR1 ScFv-內(nèi)切酶G(anti ROR1 scFv-endog)蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型中，將一種靶向ROR1胞外區(qū)的治療型免疫毒素-非免疫原性人內(nèi)切酶G酶選擇性地傳遞到ROR1+腫瘤細(xì)胞中時(shí)，這種屬于終末期凋亡分子的免疫毒素可以快速導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。然而，ADC中某些偶聯(lián)藥物在抗腫瘤活動(dòng)中可能存在副作用需要我們認(rèn)真對(duì)待，比如蒽環(huán)類藥物可能導(dǎo)致心臟的毒副作用[39]；甚至還有報(bào)道指出抗體藥物偶聯(lián)T-DM1在治療人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)陽(yáng)性的乳腺癌時(shí)，通過ROR1激活Hippo轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP1，誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤耐藥性[40]。

6 嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)

嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法(CAR-T療法)，其基本概念是利用基因工程技術(shù)將CARs修飾腫瘤患者自身T細(xì)胞[41,42]，以激活效應(yīng)細(xì)胞達(dá)到有效殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，這是一種能夠精準(zhǔn)、快速、高效，且有可能治愈癌癥的新型腫瘤細(xì)胞免疫方法[43-45]。有多項(xiàng)研究指出，CARs的功能通常集中在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域，研究者們重申應(yīng)堅(jiān)持為胞外間隔的每個(gè)目標(biāo)分子和表位進(jìn)行獨(dú)立定制的原則，并強(qiáng)調(diào)相互作用的CAR-T與腫瘤細(xì)胞之間存在重要的空間需求[26]。

早期，Hudecek等[46]在臨床試驗(yàn)中將特異性ROR1 CAR-T靶向ROR1+B型急性淋巴細(xì)胞白血病(B-acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)產(chǎn)生了前所未有的抑癌效果。在此基礎(chǔ)上，利用靶向ROR1胞外Ig-like/FZD的mAb 2A2制備2A2 CAR-T,并截短其間隔域,獲得對(duì)ROR1+腫瘤的識(shí)別。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，利用靶向ROR1 Ig-like和FZD上的一個(gè)獨(dú)立表位的兔抗人ROR1 mAb R12制備R12 CAR-T，與2A2 CAR-T相比較時(shí)，展現(xiàn)出了更高的親和性[47,48]；而且針對(duì)體內(nèi)ROR1+B細(xì)胞淋巴瘤和體外多種上皮性腫瘤都表現(xiàn)出了很好的反應(yīng)活性[26]；隨后，通過改造與修飾R12 CAR-T的空間間隔，明顯地提升其對(duì)ROR1+腫瘤的識(shí)別及擴(kuò)大T細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)[49]。以此，Berger等[50]進(jìn)一步研究證實(shí)，R12 CAR-T產(chǎn)生的生物效應(yīng)在針對(duì)人類和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物之間的同源腫瘤相關(guān)分子中具有實(shí)用安全性。這項(xiàng)技術(shù)成果已被轉(zhuǎn)化運(yùn)用于臨床I期。此外，Peng等[48]發(fā)現(xiàn)，與R12有重疊表位的XBR1-402 CAR-T，其CAR-T細(xì)胞和靶細(xì)胞膜之間的最佳間距為短間隔時(shí)產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞的增殖速度比長(zhǎng)間隔區(qū)的更快，IFN-γ和IL-2的分泌也增多，可是其體外細(xì)胞毒性是等效的。與抗人ROR1 mAbR11有重疊表位的XBR1-401 CAR-T的最佳間距卻是長(zhǎng)間隔[47]。另外，陳玥等[51]成功構(gòu)建的靶向ROR1 CAR-T，在多種ROR1+實(shí)體瘤細(xì)胞中也表現(xiàn)出了顯著的腫瘤殺傷效果。但是，值得注意的是，CAR-T細(xì)胞清除腫瘤的持續(xù)時(shí)間還有待確定[50]。

7 雙特異性抗體(BiAb)

BiAb由兩條不同的重鏈(VH)和輕鏈(VL)組成，可結(jié)合2個(gè)不同的特異性抗原表位，選擇性地激活免疫反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是靶細(xì)胞和功能單位分子之間的一座重要橋梁[22,52]。BiAb特異性連接T細(xì)胞，其作用機(jī)制與CAR-T相似，主要利用T細(xì)胞來對(duì)抗腫瘤細(xì)胞；但與CAR-T不同的是，其制備和給藥方式卻類似于常規(guī)單抗，并能從患者體內(nèi)清除。Qi等[53]根據(jù)雙抗CD19×CD3 BITE的原理設(shè)計(jì)，生產(chǎn)的一組異二聚體和糖基化形式的雙特異性ROR1×CD3 ScFv-Fc，其可以延長(zhǎng)循環(huán)T1/2近1周和減少系統(tǒng)性T細(xì)胞激活引起的副作用。而且，在血液和實(shí)體惡性腫瘤細(xì)胞中，針對(duì)ROR1 KRD中膜近端表位結(jié)合的R11 BiAb比膜遠(yuǎn)端表位結(jié)合的R12 BiAb，其T細(xì)胞具有更大的選擇性與抗腫瘤效應(yīng),這主要取決于雙抗的ROR1-和CD3-接合臂之間的間距以及其表位在ROR1和CD3上的位置[27]。

8 雙特異性T細(xì)胞銜接器(bi-specific T-cell engager，BiTe)

結(jié)合BiAb理論，人們不僅提出BiTE的設(shè)計(jì)思路，還拓展其在臨床治療的應(yīng)用范圍。與BiAb相比較，BiTE沒有FC結(jié)構(gòu)域，其表現(xiàn)簡(jiǎn)單且靈活度非常高，一只手臂連接著腫瘤抗原，另一只手臂關(guān)聯(lián)著特異性CD3亞基。在體內(nèi)，這樣的構(gòu)造設(shè)計(jì)不需要共刺激或常規(guī)MHC識(shí)別，而只是定向于腫瘤部位募集和激活多克隆T細(xì)胞去發(fā)揮多樣性免疫效應(yīng)[54]。Gohil等[28]利用一組與ROR1 Ig-like或FZD結(jié)合的抗ROR1抗體分別制備特異性的scFv與小鼠CD3 scFv成功構(gòu)建ROR1 BiTE，這些CD3scFv都能特異性地結(jié)合人T細(xì)胞；而且靶向ROR1 FZD的BiTE比靶向Ig-like的BiTE在ROR1+癌細(xì)胞株中更能產(chǎn)生持續(xù)優(yōu)越且可重復(fù)的細(xì)胞毒性；此外，這種靶向ROR1 FZD的BiTE，在ROR1+胰腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞以及一系列不同組織學(xué)形態(tài)的實(shí)體腫瘤細(xì)胞中，均能激活T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性效應(yīng)。

9 結(jié)語(yǔ)

無論是雜交瘤單克隆抗體技術(shù)還是基因抗體工程技術(shù)，靶向ROR1結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵功能區(qū)制備的抗體在腫瘤免疫治療方面均表現(xiàn)出與腫瘤抗原的高度識(shí)別性以及顯著抗腫瘤活性的效果。由此可以看出，靶向ROR1的腫瘤免疫治療已經(jīng)發(fā)展成為一種有希望的防癌與治癌措施。