劉 倩，宋文濤，樊國印，熊衍文，陳海嬰1,，吳 葵

在脊椎動物中，鳥類是地球上最普遍存在的物種之一，擁有超過10 000個現(xiàn)存物種，也是最多樣化的物種之一[1]。鳥類的分布遍及全球，每年數(shù)以億計(jì)的鳥類在各個大洲之間持續(xù)流動，它們能夠跨越生物和地理的邊界，在廣闊的地理空間范圍內(nèi)遷徙[2]。鳥類可以通過直接傳播，或作為病原體的載體，例如禽類病原體和人獸共患病病原體，也可以傳播抗生素耐藥性細(xì)菌，成為許多人類和動物疾病的感染來源[3-4]。候鳥在遷徙過程中的覓食、排泄等行為，使其更可能成為寄生蟲或其他微生物跨地域傳播的帶菌者和傳播者。由于這些特點(diǎn)，鳥類在微生物的傳播過程中起著重要的作用，從而影響微生物的動態(tài)，影響各種病毒和細(xì)菌的生態(tài)和進(jìn)化[5]。

目前我們對鳥類腸道微生物的研究十分有限，且主要集中于一些人工養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)物種，如家雞、火雞、家鴨和鴕鳥等，野生鳥類則相對較少。早期人們對腸道微生物的研究主要通過直接從PCR擴(kuò)增子構(gòu)建克隆文庫進(jìn)行測序，或通過指紋圖譜分析[6-7]。相對于高通量測序(High-throughput sequencing，HTS)，如454焦磷酸測序和Illumina測序平臺[8]，克隆測序和指紋技術(shù)通量低且耗時(shí)長。近年來，測序技術(shù)的進(jìn)步使人們對人、鼠等哺乳動物腸道微生物的認(rèn)識快速提升，但對鳥類腸道微生物的研究相對滯后。本文在簡要介紹高通量測序技術(shù)的基礎(chǔ)上，綜述了其在鳥類腸道微生物研究中的進(jìn)展。

1 描述鳥類腸道微生物的測序策略

1.116S rDNA測序 16S rDNA 測序技術(shù)是用于常規(guī)微生物組分析的最重要的不依賴于培養(yǎng)的方法之一。16S rDNA是原核生物染色體中編碼核糖小亞基的DNA序列，人們根據(jù)其序列變異特點(diǎn)將其分為9個可變區(qū)和10個保守區(qū)[9]，其中保守區(qū)序列反映了物種間的親緣關(guān)系，而可變區(qū)序列則能體現(xiàn)物種間的差異。針對16S rDNA測序，主要有兩種方法：一種是以454焦磷酸測序和Illumina為代表的二代測序技術(shù)，但是受測序長度的限制，往往只能選擇1～3個可變區(qū)作為擴(kuò)增片段(目前鳥類腸道菌群研究常用擴(kuò)增子片段是V3～V4區(qū))，但分類的準(zhǔn)確性和一致性存在問題。另一種則是以PacBio和Nanopore為代表的三代測序技術(shù)，可以得到16S rDNA基因全長序列，相對于二代測序，其檢測到的物種多樣性和生態(tài)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度更高且更準(zhǔn)確，但測序成本相對較高且存在一定的測序錯誤率[10]。

1.2宏基因組測序 宏基因組學(xué)(元基因組學(xué)，Metagenomics)[10]是指應(yīng)用高通量測序技術(shù)對樣品中存在的全部DNA含量進(jìn)行測序，而與來源無關(guān)。目標(biāo)樣品中包含的模板DNA可直接進(jìn)行測序，而無標(biāo)記基因擴(kuò)增步驟。宏基因組學(xué)不僅能夠提供關(guān)于鳥類腸道內(nèi)病毒的信息，而且能夠?qū)λ拗骶€粒體DNA進(jìn)行表征，從而識別宿主物種，指示飲食偏好，并從新鮮的糞便樣本中識別細(xì)菌種群。與16S rDNA測序相比，宏基因組學(xué)方法的主要優(yōu)勢在于能夠?qū)⑽⑸锝M中的細(xì)菌表征為“種”水平。此外，宏基因組學(xué)還提供了有關(guān)整個基因庫、基因組結(jié)構(gòu)和組織、微生物群落結(jié)構(gòu)和樣品中存在的進(jìn)化關(guān)系的全面信息。因此，與16S rDNA標(biāo)記基因方法相比，宏基因組測序具有明顯的優(yōu)勢。宏基因組方法的主要挑戰(zhàn)是生成的序列數(shù)據(jù)量大。與基于16S rDNA的方法相比，這種方法成本較高。此外，數(shù)據(jù)分析需要一定的生物信息學(xué)基礎(chǔ)以及長期的經(jīng)濟(jì)投資，而這只有在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室才有可能實(shí)現(xiàn)。由于目前仍缺乏專門設(shè)計(jì)的參考數(shù)據(jù)庫，使得在嘗試常規(guī)提取生物學(xué)信息時(shí)使用該技術(shù)具有挑戰(zhàn)性。

1.3宏轉(zhuǎn)錄組測序 宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Metatranscriptomics)[11]是特定時(shí)期環(huán)境樣本、組織樣本中所有的微生物的RNA(轉(zhuǎn)錄本)的集合。通過對這些轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行大規(guī)模高通量測序，可以直接獲得環(huán)境中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物轉(zhuǎn)錄組信息。這項(xiàng)技術(shù)除了可以區(qū)分微生物群落中的活菌群外，還可以對微生物群落中不同的細(xì)菌成員進(jìn)行功能表征。在復(fù)雜的微生物樣品中，不同的微生物群落會相互作用，從而降解、破壞或發(fā)酵基質(zhì)的有機(jī)成分。對這些樣本中純化的RNA進(jìn)行測序?qū)⑻峁┫嚓P(guān)細(xì)菌群落如何相互作用的基本描述。然而宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)也有一定局限性。首先，很難從環(huán)境樣品中獲得高質(zhì)量和足量的RNA；其次，將目標(biāo)mRNA與高豐度的RNA類型(例如rRNA)分開是一個挑戰(zhàn)；第三，mRNA的半衰期短導(dǎo)致難以做到對環(huán)境變化的快速和短期響應(yīng)；第四，參考數(shù)據(jù)庫不足[12]。

2 高通量測序技術(shù)在鳥類腸道微生物研究中的應(yīng)用

2.1揭示鳥類腸道菌群的多樣性 高通量測序技術(shù)在鳥類腸道菌群中的應(yīng)用尚處于起步階段，較早的報(bào)道見于2013年對鴯鹋盲腸菌群的多樣性研究[13]。鳥類的消化道由食道、嗉囊、腺胃(前胃)、肌胃(砂囊)、小腸、盲腸、結(jié)腸、泄殖腔組成，其核心微生物主要由4個門構(gòu)成：厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)[14]。與哺乳動物相比，鳥類的胃腸道相對較短，消化過程需要不到3.5小時(shí)，這使其形成一個具有很強(qiáng)選擇性和適應(yīng)性的微生物組。Bodawatta等人[15]利用高通量測序發(fā)現(xiàn)了新幾內(nèi)亞雀形目鳥類消化道微生物菌群的差異。這些差異與鳥類的食性(食蟲或雜食鳥類)有關(guān)。相比之下，在野生紅嘴鴉的研究中，口咽、消化道、小腸和大腸4個部位的優(yōu)勢菌門的相對豐度之間沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異。此外，這4個消化道部位中的菌群多樣性和豐富度指數(shù)也沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異[16]。

在脊椎動物中，哺乳動物的飲食和宿主系統(tǒng)發(fā)育地位驅(qū)動著腸道菌群變化，但這種驅(qū)動模式是否適用于所有鳥類尚不清楚。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了一系列影響鳥類腸道微生物組成和多樣性的因素。例如Dong等人[17]通過16S rDNA的高變區(qū)V3～V4測序，對不同地區(qū)的白頭鶴腸道菌群多樣性的研究發(fā)現(xiàn)在不同的取樣地點(diǎn)和越冬期白頭鶴腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性存在顯著差異，而環(huán)境因素可能是影響腸道菌群組成的重要因素。除此之外，Bodawatta等人[15]也發(fā)現(xiàn)宿主飲食與宿主系統(tǒng)發(fā)育對鳥類腸道菌群均有一定影響，但宿主飲食的影響似乎更大。最近一項(xiàng)研究[18]納入了315種哺乳動物和491種鳥類，分析發(fā)現(xiàn)鳥類和能飛行的哺乳動物—蝙蝠的菌群組成相似性高，在不具備飛行能力的哺乳動物中，飲食和短期進(jìn)化親緣關(guān)系驅(qū)動著腸道菌群組成變化，但鳥類和飛行類哺乳動物—蝙蝠打破了這種模式，提示飛行的適應(yīng)性或破壞了宿主和微生物之間長期存在的共進(jìn)化關(guān)系。由此可見，鳥類的物種豐富，生活史特征多種多樣，需要納入更多、更廣泛的個體來評估環(huán)境、宿主、飛行等因素對鳥類腸道菌群的影響。

2.2研究抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs) 近年來，許多細(xì)菌感染變得越來越難以治療，部分原因是由于人類病原體對抗生素的耐藥性增加。最近的研究表明，環(huán)境和野生動物都是抗性基因多樣性的主要來源和宿主[19]。鳥類的生態(tài)位多樣化且容易接觸到人類和環(huán)境中的細(xì)菌，成為包括病原體在內(nèi)的不同細(xì)菌物種的帶菌者和傳播者，且可能遠(yuǎn)距離傳播含有抗生素抗性基因的病原體[20-21]，這在一定程度上可能導(dǎo)致了耐藥基因在細(xì)菌間的擴(kuò)散和傳播。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，鳥類腸道菌群中的ARGs類型幾乎對臨床和農(nóng)業(yè)常用的所有主要抗生素類別都具有耐藥性[22]。因此，進(jìn)行特定系統(tǒng)的整個微生物群對抗生素耐藥性的研究是很重要的。

雖然對鳥類抗生素的大多數(shù)研究都是基于體外培養(yǎng)的細(xì)菌，但高通量測序技術(shù)的發(fā)展極大地?cái)U(kuò)展了我們對環(huán)境中耐藥基因庫的認(rèn)識。整個轉(zhuǎn)錄組的基因測序(即宏轉(zhuǎn)錄組)對于抗生素耐藥性基因的研究具有很多優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)楹贽D(zhuǎn)錄組可以從整個微生物群落獲得數(shù)據(jù)，尤其是功能活躍的基因，而非必需的基因往往會丟失[23]。Marcelino等人[24]應(yīng)用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)對110只鳥類的糞便樣本進(jìn)行了研究，評估澳大利亞水鳥和南極洲企鵝的腸道微生物組中轉(zhuǎn)錄的ARGs的多樣性和豐富性。研究發(fā)現(xiàn)即使在澳大利亞和南極洲等偏遠(yuǎn)地方的鳥類也具有廣泛的抗生素耐藥性，并且與人類廢棄物接觸(即使經(jīng)過污水處理)似乎會影響禽類野生生物對ARGs的獲取。以高通量測序技術(shù)為基礎(chǔ)的宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一項(xiàng)強(qiáng)大的工具，即使目前相關(guān)文庫的數(shù)量相對較少，也有可能在不同地區(qū)的鳥類之間進(jìn)行有意義的比較，從而為將來的研究提供指導(dǎo)。

2.3發(fā)現(xiàn)鳥類攜帶的病原微生物 鳥類是許多新發(fā)傳染病和人獸共患病病原體的宿主，其體內(nèi)外經(jīng)常帶有一些病原微生物，包括禽流感病毒、沙門氏菌、彎曲菌、西尼羅病毒等[25-27]。不論是人獸共患病或是動物源性傳染病均為威脅人類健康的重大隱患，威脅著全球公共衛(wèi)生安全。高通量測序可以幫助快速識別特定樣本中存在的致病菌和病毒，這在一定程度上提高了我們對病原微生物多樣性和進(jìn)化的了解，并有助于估計(jì)對家禽或人類的潛在風(fēng)險(xiǎn)，為病原體的鑒定、人類傳染病的診斷提供幫助[28-29]。

高通量測序在鑒定未知病原微生物方面具有巨大的優(yōu)勢。孟祥莉等人[30]利用 PacBio RS Ⅱ 三代高通量測序技術(shù)獲得近似16S rRNA基因全長序列，分析得到青藏高原禿鷲腸道中已知種的102個OPUs，有45個OPUs為人臨床樣本中分離的病原菌或者引起過人類疾病暴發(fā)的病原菌，例如類志賀鄰單胞菌、梭狀芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血葡萄球菌以及泡囊短波單胞菌等，其中致病性產(chǎn)氣莢膜梭菌在禿鷲的腸道菌群中豐度最高，此外還從禿鷲的糞便中分離得到了3株可能具有致病性的放線菌。Truchado等人[31]利用病毒宏基因組學(xué)(Virome)首次在一個偏遠(yuǎn)地區(qū)的野生鳥類種群中檢測到了一種新的Gyrovirus—GyV11，糞—口途徑可能是Gyrovirus的主要傳播途徑，但其在禽類中的致病機(jī)理，是否可以感染人或雞，尚需要進(jìn)一步研究。以上研究均表明高通量測序?qū)﹃U明病原微生物的結(jié)構(gòu)和起源、理解病原感染可能如何影響鳥類種群的健康以及鳥類作為可能感染其他動物物種病原的潛在來源都十分重要。

此外，高通量測序的發(fā)展，促進(jìn)了病毒學(xué)的研究從傳統(tǒng)簡單的單宿主、單病毒發(fā)展為多宿主、多病毒的研究，使得探索野生鳥類中決定病毒群落結(jié)構(gòu)的因素成為可能。關(guān)于鳥類目Anseriformes和Charadriiforme的研究則很好的證明了這一點(diǎn)。Wille等[32]通過宏轉(zhuǎn)錄方法描述了隸屬于這兩種鳥類目中9種鳥類的病毒組特征，鑒定出27種病毒，其中有24種是新病毒。在這些樣本中病毒豐度、α多樣性等存在著大規(guī)模的異質(zhì)性以及一定程度的連通性，并且宿主生態(tài)學(xué)的各個方面，如覓食生態(tài)學(xué)在塑造病毒組組成方面可能比宿主分類學(xué)更為重要。另一項(xiàng)研究[33]中也表明，相較于宿主分類學(xué)，感染甲型流感的狀態(tài)、地理位置等似乎對鳥類中病毒組的豐度及多樣性的影響更大，即在病毒組結(jié)構(gòu)方面，宿主生態(tài)學(xué)可能比宿主分類學(xué)起到更為重要的作用。

3 結(jié)語與展望

基于高通量測序技術(shù)的16S rDNA測序、宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)等，給微生物研究帶來了革命性的變化，也推動了鳥類腸道微生物的研究。未來隨著高通量測序的成本進(jìn)一步降低、生物信息學(xué)分析技術(shù)提高以及廣泛推廣，其將在鳥類腸道菌群、ARGs以及鳥類相關(guān)病原微生物等領(lǐng)域取得更為顯著的成果，對新發(fā)傳染病發(fā)現(xiàn)及溯源、人畜共患病的防控和ARGs監(jiān)測等具有重要指導(dǎo)意義。

利益沖突：無