索德成，魏書(shū)林，肖志明，王培龍，王瑞國(guó)，李陽(yáng)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定飼用血液制品中18種β-受體激動(dòng)劑

索德成，魏書(shū)林，肖志明，王培龍，王瑞國(guó)，李陽(yáng)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081）

【背景】飼用血液制品是一種非常規(guī)動(dòng)物源性飼料原料，由家畜或家禽的血液凝成塊后經(jīng)高溫蒸煮，壓除汁液、晾曬、烘干后粉碎而成，主要用于畜牧養(yǎng)殖。但由于動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中存在非法使用β-受體激動(dòng)劑的現(xiàn)象，一些含有β-受體激動(dòng)劑的血液制成飼用血液制品可能成為對(duì)人類(lèi)健康潛在的危害源頭。為了降低安全風(fēng)險(xiǎn)，研究飼用血液制品中β-受體激動(dòng)劑的方法是十分必要的。β-受體激動(dòng)劑檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）法、高效液相色譜（HPLC）法、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法等。目前所有方法或標(biāo)準(zhǔn)大多針對(duì)商業(yè)成品飼料或動(dòng)物源性食品，缺乏對(duì)飼用血液制品中β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行相關(guān)的研究。【目的】為了研究和監(jiān)控飼用血液制品中β-受體激動(dòng)劑的情況，研究建立了固相萃取結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)飼用血液制品中18種β-受體激動(dòng)劑的方法。【方法】稱(chēng)取2 g（精確至0.01 g）血液制品樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL乙酸銨提取液（pH=5.2）和50 μLβ-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，漩渦混合均勻，于37 ℃水解過(guò)夜（應(yīng)大于16h），然后8 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入0.5mL 高氯酸溶液，漩渦混合30 s, 然后于8 000r/min離心5min，上清液備用。PCX固相萃取小柱依次用3 mL甲醇，3 mL水活化。取上清液過(guò)柱，用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，抽干，用3 mL氨水甲醇溶液洗脫，洗脫液于50 ℃氮?dú)獯抵两?，?.0 mL 0.1%甲酸水+乙腈溶液（95+5）溶解，過(guò)0.22 μm濾膜。進(jìn)Waters TQ液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，使用ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm,2.1 mm，1.7μm) 色譜柱。乙腈和0.1％甲酸溶液做流動(dòng)相，梯度洗脫。質(zhì)譜電離方式采用電子噴霧離子源，正離子檢測(cè)方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（HRM）。噴霧電壓為3.5 kV；霧化氣溫度為480℃；源溫度為150℃；霧化氣流速為600L·h-1；錐孔氣流速為5 L·h-1。脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮?dú)??！窘Y(jié)果】18種β-受體激動(dòng)劑在5—100μg·L-1呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.99—0.999之間。在血粉、血漿蛋白粉、血球蛋白粉三種基質(zhì)中在5、10 和50 μg·kg-1三個(gè)添加水平上的平均回收率為65.1%—110%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，批間變異系數(shù)小于20%。檢出限為低于5ng·g-1?！窘Y(jié)論】從方法回收率、精密度結(jié)果及實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，該方法適用于血液制品中β-受體激動(dòng)劑的監(jiān)測(cè)。

β-受體激動(dòng)劑；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；飼用血液制品

0 引言

【研究意義】β-受體激動(dòng)劑（β-agonists）俗稱(chēng)“瘦肉精”，是苯乙胺類(lèi)藥物。在醫(yī)學(xué)主要用于擴(kuò)張支氣管和增加肺通氣量，治療支氣管哮喘。β-受體激動(dòng)劑能顯著提高動(dòng)物酮體瘦肉率、增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率。因此，β-受體激動(dòng)劑被非法使用于畜牧生產(chǎn)，以促進(jìn)家畜生長(zhǎng)和改善肉質(zhì)[1-4]。導(dǎo)致了動(dòng)物性食品中藥物殘留嚴(yán)重超標(biāo)，消費(fèi)者食用這類(lèi)食品后會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，至今已發(fā)生了多起“瘦肉精”集體中毒事件[5-8]。為此，中國(guó)和歐盟禁止β-受體激動(dòng)劑在動(dòng)物養(yǎng)殖中使用[8-11]。飼用血液制品是一種非常規(guī)動(dòng)物源性飼料原料，由家畜或家禽的血液凝成塊后經(jīng)高溫蒸煮，壓除汁液、晾曬、烘干后粉碎而成，其主要類(lèi)型有血粉、血漿蛋白粉、血球蛋白粉等[12]。其在畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中大量應(yīng)用[13-15]。由于血液制品的加工原料來(lái)源自于動(dòng)物血液，如果在生產(chǎn)過(guò)程中使用了含有β-受體激動(dòng)劑的動(dòng)物血液，常規(guī)加工無(wú)法將殘留于血液中的β-受體激動(dòng)劑去除，會(huì)使β-受體激動(dòng)劑在飼用血液制品中殘留，進(jìn)而影響飼料質(zhì)量和畜產(chǎn)品安全。因此，為了評(píng)價(jià)飼用血液制品中含有β-受體激動(dòng)劑風(fēng)險(xiǎn)，建立飼用血液制品中β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)方法是十分必要的?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前國(guó)際上β-受體激動(dòng)劑檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）法、高效液相色譜（HPLC）法、氣質(zhì)聯(lián)用（GC/MS）法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法[16-28]，BUCKNALL 等建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)法用于檢測(cè)牛肝中的克倫特羅殘留，檢測(cè)限達(dá)到0.5 ng·g-1[16]。KOOLE 等應(yīng)用免疫親和凈化，建立了高效液相色譜檢測(cè)尿液中5種β-受體激動(dòng)劑的方法，檢測(cè)限達(dá)到ng·mL-1水平[20]。LIU等研究建立GC-MS檢測(cè)牛組織中β-受體激動(dòng)劑的方法，應(yīng)用N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺進(jìn)行衍生, 檢測(cè)限達(dá)到5 ng·g-1 [22]。ELISA為目前主流的篩選方法。但是無(wú)法對(duì)樣品中β-激動(dòng)劑含量進(jìn)行定量確證；液相色譜法對(duì)樣品基質(zhì)要求較高，檢測(cè)限較高，無(wú)法滿(mǎn)足監(jiān)測(cè)要求；氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定β-激動(dòng)劑需要衍生，樣品重復(fù)性差。近年應(yīng)用LC-MS/MS進(jìn)行β-激動(dòng)劑多殘留檢測(cè)的研究日趨增多[25-28]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】現(xiàn)有方法或標(biāo)準(zhǔn)大多針對(duì)商業(yè)成品飼料或動(dòng)物源性食品，目前尚無(wú)飼用血液制品中β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)技術(shù)，這在一定程度上加大了飼料企業(yè)使用血液制品的風(fēng)險(xiǎn)，也限制了政府部門(mén)對(duì)β-受體激動(dòng)劑的有效監(jiān)管，因此，亟需飼用血液制品中β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)方法?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】針對(duì)血液制品成分復(fù)雜、蛋白質(zhì)和脂肪含量高的問(wèn)題，通過(guò)摸索液相質(zhì)譜條件的優(yōu)化、提取、凈化方法，建立了一種準(zhǔn)確、靈敏測(cè)定飼用血液制品中18種β-受體激動(dòng)劑含量的LC-MS/ MS方法。為飼用血液制品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和政府監(jiān)管提供必要的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014年6—10月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 儀器與試劑

Acquity 超高效液相色譜帶有TQ三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）；PCX混合型陽(yáng)離子交換柱（美國(guó)Agilent公司）。MS2 漩渦混合器（德國(guó)IKA 公司）；Centrifuge 5810 離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；固相萃取裝置（美國(guó)Supelco 公司）。

除非另有說(shuō)明，所用試劑均為分析純，購(gòu)自于北京化學(xué)試劑公司。流動(dòng)相所用試劑甲酸，乙腈、甲醇均為色譜純（Fisher ChenAlert Guide 公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Mili-Q純化后的超純水（＞18 MΩ）。克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、齊帕特羅、氯丙那林、特布他林、西馬特羅、西布特羅、馬布特羅、溴布特羅、班布特羅、克侖普羅、妥布特羅、利托君、沙美特羅、克倫塞羅、福莫特羅和苯乙醇胺A對(duì)照品分別購(gòu)自于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司、美國(guó)Sigma公司等：純度≥97%。飼用血液制品（血粉、血漿蛋白粉、血球蛋白粉）樣品從配合飼料生產(chǎn)工廠(chǎng)的原料庫(kù)采集，其來(lái)源于中國(guó)、美國(guó)、新西蘭等地。陽(yáng)性血液制品樣品的血液來(lái)源于公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（No. 201203088）的動(dòng)物試驗(yàn)[30]，參照血液制品的生產(chǎn)工藝制備成血粉，并塑封保存于0—4℃的冰箱中。

1.2 溶液配制

β-受體激動(dòng)劑貯備液：分別精密稱(chēng)取各種β-受體激動(dòng)劑對(duì)照品至棕色容量瓶中，用甲醇配成濃度約為1mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，2℃—8℃冷藏保存，有效期十二個(gè)月。

β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別精密吸取各種β-受體激動(dòng)劑貯備液，用初始流動(dòng)相稀釋成濃度為1μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。2℃—8℃冷藏保存，有效期一個(gè)月。

1.3 樣品處理

稱(chēng)取2 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL乙酸銨提取液（pH=5.2）和50 μLβ-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，漩渦混合均勻，于37 ℃水解過(guò)夜（應(yīng)大于16 h），然后8 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入0.5 mL 高氯酸溶液，漩渦混合30 s, 然后于8 000r/min離心5 min，上清液備用。

PCX固相萃取小柱依次用3 mL甲醇，3 mL水活化。取上清液過(guò)柱，用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，抽干，用氨水甲醇溶液3 mL洗脫，洗脫液于50 ℃氮?dú)獯抵两桑?.0 mL初始流動(dòng)相溶解，過(guò)0.22 μm濾膜。供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

同時(shí)選取待測(cè)樣品類(lèi)型相同的空白血液制品（血粉、血球蛋白粉、血漿蛋白粉）樣品，按上述步驟處理，在凈化、吹干后的殘?jiān)校謩e添加適量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配置成不同濃度（1—100μg·L-1）的基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)定量。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm, 2.1 mm，1.7μm）柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相及參考梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相及參考梯度洗脫程序

質(zhì)譜采用電子噴霧離子源，正離子檢測(cè)方式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（HRM）。噴霧電壓為3.5 kV；霧化氣溫度為480℃；源溫度為150℃；霧化氣流速為600L·h-1；錐孔氣流速為5 L·h-1。脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮?dú)?，使用前?yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見(jiàn)表2。

表2 β-受體激動(dòng)劑的定性、定量離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞電壓的參考值

2 結(jié)果

2.1 不同提取方式對(duì)血粉樣品提取效率研究

本研究比較了4種方法對(duì)血粉陽(yáng)性樣品的檢測(cè)：1.酶解（EME）：取1g陽(yáng)性樣品，加入5mL的乙酸銨緩沖液（pH 6. 8），并加入50 μLβ-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，于37℃溫育過(guò)夜。2. 有機(jī)溶劑加酸提?。∕SE）:取1g陽(yáng)性樣品，加入5mL0.1mol·L-1鹽酸溶液+甲醇溶液提取。3. 高氯酸水解（ACE）：取1g陽(yáng)性樣品，加5mL0.2 mol·L-1高氯酸溶液，搖勻,于60℃水解4h。4.堿水解（ALE）:取1g陽(yáng)性樣品，加入5mL 0.1mol·L-1氫氧化鈉溶液，搖勻，于60℃水解4h。

結(jié)果見(jiàn)圖1，不同處理方法對(duì)各種血液制品的不同激動(dòng)劑檢測(cè)結(jié)果有所差距。對(duì)于血液制品來(lái)說(shuō)，有機(jī)溶劑提取克倫特羅和苯乙醇胺A效果較好，但是對(duì)萊克多巴胺和沙丁胺醇的提取效果很差；高氯酸水解和堿水解能提取出大部分原型藥物，但是提取效率相比酶解較低，酶解對(duì)4種常見(jiàn)激動(dòng)劑提取效果最好，同時(shí)酶解后測(cè)得的萊克多巴胺和沙丁胺醇的含量要明顯高于其他提取方法。

2.2 線(xiàn)性與檢出限（LOD）、定量限（LOQ）

以每種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，β-受體激動(dòng)劑的色譜峰面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，試驗(yàn)表明18種β-受體激動(dòng)劑在5—100μg·L-1呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.99—0.999之間。在本試驗(yàn)條件下，根據(jù)3倍噪音的峰響應(yīng)值，確定檢出限。根據(jù)回收率和精密度結(jié)果確定定量限。線(xiàn)性、檢出限和定量限的結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 不同提取方法對(duì)實(shí)際血液制品中4種受體激動(dòng)劑的結(jié)果

表3 β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)溶液線(xiàn)性、LOQ，㎏LOD

2.3 回收率與精密度

我們選取3種飼用血液制品樣品作為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，以考察方法的準(zhǔn)確度和現(xiàn)性。配制5、10和50μg·kg-1等3個(gè)濃度的試樣，每批次內(nèi)同一濃度做6次平行試驗(yàn)。批間重復(fù)3次。結(jié)果見(jiàn)表4。由表看出，方法回收率達(dá)到65.6 %—110 %之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<15%，批間變異系數(shù)小于20%。說(shuō)明該方法對(duì)不同樣品中β-受體激動(dòng)劑的測(cè)定均有較好的回收率和準(zhǔn)確度。

表4 飼用血液制品回收率與精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

續(xù)表4 Continued table 4

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

基于β-受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物都具有較強(qiáng)的水溶性，首先選擇以甲醇和水作為基本流動(dòng)相條件，但在質(zhì)譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)有些組分的檢測(cè)靈敏度較差。為了提高電離效率，優(yōu)化靈敏度參數(shù)，筆者使用0.1%甲酸水溶液和乙腈代替純水和甲醇體系。同時(shí)在流動(dòng)相條件中設(shè)置梯度條件可有效分離β-受體激動(dòng)劑。避免樣品中的基質(zhì)干擾，使得定性和定量更加準(zhǔn)確。

3.2 監(jiān)測(cè)離子對(duì)的選擇

采用100 ng·L-1β-受體激動(dòng)劑化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別以流動(dòng)注射的方式在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定標(biāo)準(zhǔn)物的分子離子,然后分別以其分子離子為母離子，進(jìn)行二級(jí)離子全掃描，選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的子離子為定性及定量離子，具體參數(shù)見(jiàn)表2。典型的分離色譜圖見(jiàn)圖2。

1：齊帕特羅、2：沙丁胺醇、3：特布他林、4：西馬特羅、5：西布特羅、6：利托君、7：克侖塞羅、8：萊克多巴胺、9：克侖普羅、10：氯丙那林、11：福莫特羅、12：妥布特羅、13：克侖特羅、14：溴布特羅、15：班布特羅、16: 馬布特羅、17：苯乙醇胺A、18：沙美特羅

3.3 樣品前處理方法的確定

3.3.1 提取液及提取方式的選擇 β-受體激動(dòng)劑經(jīng)過(guò)在動(dòng)物體內(nèi)吸收、代謝的一系列生化反應(yīng)，大部分β-受體激動(dòng)劑能生成葡萄糖苷酸或硫酸等軛合代謝物[1]，因此，血液制品中β-受體激動(dòng)劑的殘留主要以軛合物存在，因此在測(cè)定血液制品中β-受體激動(dòng)劑前，首先要將軛合型β-受體激動(dòng)劑解離。李陽(yáng)等研究了酶解及有機(jī)溶劑提取對(duì)綿羊血漿中萊克多巴胺和沙丁胺醇含量測(cè)定的影響，結(jié)果表明，綿羊血漿中萊克多巴胺軛合率大于95%，沙丁胺醇軛合率約為40%，使用β葡萄糖醛苷/芳基硫酸酯酶可有效解離血漿中軛合的萊克多巴胺和沙丁胺醇[25]。強(qiáng)致懿等在65 ℃條件下用20μL葡萄糖苷酶酶解萊克多巴胺，發(fā)現(xiàn)酶解之后血液中萊克多巴胺含量要比酶解前高出1.5—2.5倍[29]。雖然目前還沒(méi)有關(guān)于其他受體激動(dòng)劑在動(dòng)物血液內(nèi)的存在形式的報(bào)道，但是結(jié)合β-受體激動(dòng)劑在其他組織的代謝規(guī)律和對(duì)陽(yáng)性血粉樣品結(jié)果（圖 1）可以認(rèn)為：酶解能有效地將軛合態(tài)β-受體激動(dòng)劑解離，而且酶解的特異性較高，酶形成的雜質(zhì)較少，更有利于目標(biāo)物的濃縮和凈化[26-27]。因此，本試驗(yàn)選擇用β葡萄糖醛苷/芳基硫酸酯酶來(lái)酶解樣品中β-受體激動(dòng)劑軛合代謝物。

由于血粉樣品含有大量水溶性血紅蛋白，經(jīng)過(guò)酶解后樣品提取液殘存大量的蛋白質(zhì)，對(duì)下一步SPE凈化有很大的影響，需采取手段沉淀蛋白。我們比較了乙酸鉛溶液和高氯酸溶液沉淀蛋白質(zhì)效果，表明高氯酸溶液效果較好，凈化效果見(jiàn)圖3。同時(shí)比較加入0.5 mL 5%、10%、30%、50%的高氯酸溶液對(duì)沉淀蛋白質(zhì)效果和回收率的影響，綜合考慮，0.5 mL 30%高氯酸溶液效果最好。

圖3 高氯酸溶液處理前后對(duì)比圖

3.3.2 凈化 目前常用的β-受體激動(dòng)劑樣品凈化主要有兩種方式，液液萃取和固相萃取。本試驗(yàn)選取了液液萃取，弱陽(yáng)離子交換柱、C18柱，混合型陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行比較。結(jié)果表明混合型陽(yáng)離子交換柱凈化效果較好，并且對(duì)實(shí)際樣品的回收率較好，綜合回收率和對(duì)空白樣品和添加樣品的凈化效果，最終選取混合型陽(yáng)離子交換柱對(duì)樣品進(jìn)行分離富集。同時(shí)，本研究中比較各種商品化了的混合型陽(yáng)離子交換柱（包括Agilent Bond Elut Plexa PCX，Agela PCX 2, Oasis MCX柱）的凈化效果，結(jié)果表明都對(duì)β-受體激動(dòng)劑凈化有非常好的效果。

3.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是LC-MS/MS 檢測(cè)的最常見(jiàn)的問(wèn)題。不同血液制品樣品的組成比較復(fù)雜，其中含有大量的的蛋白質(zhì)、脂肪和鹽等干擾物，會(huì)對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度和準(zhǔn)確性造成一定的影響，進(jìn)而影響試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果。不同的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度造成的影響也不同，為了降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量準(zhǔn)確度的影響。本研究采用基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)定量以彌補(bǔ)離子抑制造成的損失。

3.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用建立的方法，對(duì)50份隨機(jī)收集飼用血液制品樣品進(jìn)行測(cè)定，5份樣品檢出β-受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物殘留，其他未檢出β-受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物殘留。陽(yáng)性樣品中1份檢出西馬特羅、含量為234 ng·g-1。4份檢出萊克多巴胺，含量為 35—432ng·g-1之間。萊克多巴胺的檢出血粉主要集中于美國(guó)進(jìn)口的產(chǎn)品中，可能與美國(guó)允許使用萊克多巴胺作為飼料添加劑有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究建立了基于酶解法對(duì)飼用血液制品中β-受體激動(dòng)劑殘留的提取，采用PCX固相萃取柱濃縮凈化，UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)飼用血液制品中18種β-受體激動(dòng)劑，方法回收率和精密度符合痕量分析的要求，操作簡(jiǎn)便、分析效率高，可用于相關(guān)樣品的日常檢測(cè)及殘留監(jiān)控。

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Simultaneous Determination of 18 β-agonists in Blood Products for Feeds by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

SUO DeCheng, WEI ShuLin, XIAO ZhiMing, WANG PeiLong, WANG RuiGuo, LI Yang

(Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agricultural Product, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

【Background】Blood product for feeds is a kind of unconventional animal-derived feed material. It is made through coagulating the blood of livestock or poultry, cooking at high temperature, pressing out juice, drying and grinding. However, due to the existence of illegal use of β- agonists, the use of blood product from blood containing β-agonists may become a potential source of harm to human health. In order to reduce the safety risk, it is necessary to study the methods of β-agonists in blood product for feeds. The detection methods of β-agonists include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). At present, most of the methods or standards are aimed at commercial finished feed or animal-derived food, however there is a lack of relevant research on the detection technology of β-agonists in blood product for feeds. 【Objective】In order to study and monitor the status of β-agonists in blood product for feeds, a method of LC-MS/MS combined with solid phase extraction (SPE) was developed for the determination of 18 β-agonists in blood product for feeds.【Method】2 g (accurate to 0.01 g) blood product sample was weighed in 50 mL centrifugal tube, and then 20 mL ammonium acetate extract (pH=5.2) and 50 mL beta-glucuronidase/arylsulfatase were added accurately. The eddies were mixed evenly hydrolyzed overnight at 37 (>16 hours), then centrifuged for 5 min at 8 000 r/min, the supernatant was transferred to another centrifugal tube, and 0.5 mL 30% perchloric acid solution was added. After vortex mixing for 30 seconds and centrifugation for 5 minutes at 8 000r/min, supernatant was reserved. PCX solid phase extraction column was activated with 3 mL methanol and 3 mL water in turn. The supernatant was load and washed by 3 mL water and 3 mL methanol, then drained, eluted by 3 mL 5% ammonia methanol solution. The eluent was blown to near dry by nitrogen at 50 °C, dissolved by 1.0 mL 0.1% formic acid water + acetonitrile solution (95+5) and filtered through 0.22 μm filter membrane, then detected by Waters TQ liquid chromatography tandem mass spectrometer. The column ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm, 2.1 mm, 1.7 μm) was used as analysis column; acetonitrile and 0.1% formic acid solution were used as mobile phase for gradient elution. The ionization modes of mass spectrometry were electron spray ion source, positive ion detection method and multi reaction monitoring (HRM), the spray voltage was 3.5 kV, the dissolvent temperature was 480 °C, the source temperature was 150 °C, flow rate of the dissolvent gas was 600L·h-1, and flow rate of the cone gas was 5 L·h-1. The dissolvent gas, cone gas and collision gas were all high purity nitrogen gas.【Result】18 β-agonists showed a good linear relationship between 5 and 100 μg·L-1, with correlation coefficients ranging from 0.99 to 0.999. The average recovery of blood powder, plasma protein powder and globulin powder was 65.1%-110% at the levels of 5, 10 and 50 μg·kg-1, and the relative standard deviation below 15%. The coefficient of variation between batches was less than 20%. The detection limit was less than 5 ng·g-1.【Conclusion】The results of recovery, precision and actual samples showed that the method was suitable for monitoring β-agonists in blood products for feed.

β-agonists; LC-MS/MS; blood products for feeds

2018-01-08；

2019-09-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（31572443）、公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（201203088）、農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂（農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全）項(xiàng)目（2015-332）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院“飼料質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

索德成，E-mail：suodecheng@caas.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）