彭軍波，李興紅，張瑋，周瑩，黃金寶，燕繼曄

葡萄潰瘍病菌外泌蛋白LtGH61A的致病力及基因表達(dá)模式

彭軍波，李興紅，張瑋，周瑩，黃金寶，燕繼曄

（北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所/北方果樹病蟲害綠色防控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097）

【目的】由葡萄座腔菌屬（）真菌引起的潰瘍病是葡萄生產(chǎn)上的重要病害之一，在國(guó)內(nèi)多個(gè)葡萄產(chǎn)區(qū)發(fā)生，嚴(yán)重威脅葡萄的產(chǎn)量及品質(zhì)。本研究對(duì)葡萄潰瘍病菌（）中一個(gè)假定外泌蛋白LtGH61A進(jìn)行功能分析，為進(jìn)一步解析葡萄潰瘍病菌的致病機(jī)理及病害防控提供理論依據(jù)。【方法】通過SignalP 4.0預(yù)測(cè)LtGH61A蛋白的信號(hào)肽；氨基酸序列同源比對(duì)結(jié)合基因功能注釋，預(yù)測(cè)LtGH61A蛋白的功能；通過酵母互補(bǔ)試驗(yàn)分析LtGH61A蛋白的外泌特性；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析在病原菌營(yíng)養(yǎng)菌絲及侵染寄主不同階段的表達(dá)量；借助RNA干涉（RNAi）對(duì)進(jìn)行表達(dá)抑制；通過葡萄枝干離體接種試驗(yàn)，分析LtGH61A蛋白對(duì)葡萄潰瘍病菌致病力的影響。通過比較菌落直徑，分析LtGH61A蛋白對(duì)葡萄潰瘍病菌菌絲生長(zhǎng)速率的影響?！窘Y(jié)果】信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明LtGH61A蛋白N端具有一個(gè)長(zhǎng)度為18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽；基因功能注釋推定的編碼產(chǎn)物屬于糖苷水解酶61（GH61）家族，能酶解纖維素類物質(zhì)；互補(bǔ)蔗糖酶外泌缺陷型酵母YTK12結(jié)果表明，LtGH61A蛋白的信號(hào)肽具有外泌活性，能夠引導(dǎo)酵母YTK12蔗糖酶的外泌；與營(yíng)養(yǎng)菌絲階段相比，的表達(dá)量在病原菌侵染階段顯著升高，并且在接種后48 h高達(dá)營(yíng)養(yǎng)菌絲階段的19倍；通過RNAi試驗(yàn)及qRT-PCR驗(yàn)證，獲得了2個(gè)表達(dá)量明顯降低的陽性轉(zhuǎn)化子，分別命名為RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2；葡萄枝干離體接種試驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型CSS-01s相比，RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2轉(zhuǎn)化子在葡萄枝干形成的病斑長(zhǎng)度顯著變短，約為野生型CSS-01s的55%，表明LtGH61A影響葡萄潰瘍病菌的致病力；菌落直徑比較顯示，與野生型CSS-01s相比，RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2轉(zhuǎn)化子的菌落直徑變小，約為野生型85%，表明LtGH61A影響葡萄潰瘍病菌的菌絲生長(zhǎng)速率。【結(jié)論】LtGH61A影響葡萄潰瘍病菌的致病力及生長(zhǎng)速率；LtGH61A蛋白能夠分泌至胞外；在病原菌侵染階段的表達(dá)量顯著升高，推測(cè)其通過發(fā)揮自身酶活功能，破壞寄主植物組織，從而促進(jìn)病原菌的侵染。

葡萄潰瘍病菌；外泌蛋白；致病力；表達(dá)模式；實(shí)時(shí)熒光定量PCR; RNA干涉

0 引言

【研究意義】葡萄是世界范圍內(nèi)四大水果之一，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2017年世界葡萄總產(chǎn)量約7 428萬噸，我國(guó)葡萄的總產(chǎn)量約1 316萬噸，占世界葡萄總產(chǎn)量的18%（http://www.fao.org/ statistics/zh/）。由葡萄座腔菌屬（）真菌引起的葡萄潰瘍病是我國(guó)乃至世界葡萄產(chǎn)區(qū)的重要病害之一。近年來，該病害在我國(guó)多個(gè)葡萄產(chǎn)區(qū)流行，并且有逐年加重的趨勢(shì)，危害嚴(yán)重時(shí)，產(chǎn)量損失高達(dá)80%，甚至絕產(chǎn)[1-2]。世界范圍內(nèi)，已有超過12個(gè)國(guó)家報(bào)道了葡萄潰瘍病的發(fā)生及危害，包括中國(guó)、意大利、美國(guó)、法國(guó)、西班牙及澳大利亞等葡萄產(chǎn)量大國(guó)[2]。目前生產(chǎn)上針對(duì)該病害并無高效的防控措施，主要采用改善環(huán)境條件、葡萄種植管理及殺菌劑相結(jié)合的綜合防控措施[2]。因此，探究葡萄潰瘍病菌致病關(guān)鍵因子的作用機(jī)理，對(duì)于全面解析葡萄潰瘍病的發(fā)生機(jī)理，促進(jìn)我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，建立都市型現(xiàn)代農(nóng)業(yè)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)已報(bào)道的造成葡萄潰瘍病的病原菌多達(dá)20種[3]，其中在國(guó)內(nèi)已鑒定到的葡萄潰瘍病菌有6種，包括可可毛色二孢（）[4]、色二孢屬真菌[5]、葡萄座腔菌（）[2]、小新殼梭孢（）[3]、[6]和[7]，其中可可毛色二孢是致病力最強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)種。由可可毛色二孢引起的葡萄潰瘍病于1972年首次在埃及報(bào)道[8]，在國(guó)內(nèi)由筆者研究室的科研人員首次報(bào)道[4]。關(guān)于葡萄潰瘍病的研究主要集中在病原菌的分離鑒定、生物學(xué)特性及癥狀描述[2-15]，殺菌劑防治效果、抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及作用機(jī)理的解析[16-17]、生防菌的作用機(jī)制[18]、組學(xué)分析[19-21]、病菌外泌毒素的鑒定及致病力分析[22-25]等方面，有關(guān)致病基因作用機(jī)理的報(bào)道較少。糖苷水解酶是一類在真菌中被廣泛研究報(bào)道的化合物，這些酶類在工業(yè)生物能源的再生、自然界多糖類物質(zhì)的代謝及病原菌的侵染致病中發(fā)揮了不同的作用[26-27]。目前，碳水化合物活性酶（CAZy）數(shù)據(jù)庫（http://www.cazy.org）含有超330個(gè)家族，近340 000個(gè)碳水化合物活性酶的序列信息[28]，這些水解酶能以纖維素、木質(zhì)素或幾丁質(zhì)等不同碳水化合物為底物，發(fā)揮活性功能。如嗜熱子囊菌（）產(chǎn)生的糖苷水解酶61（GH61）家族蛋白TaGH61A能夠以微晶纖維素為底物，發(fā)揮酶解活性[27]；里氏木霉（）能夠產(chǎn)生2種纖維素水解酶（Cel6A和Cel7A）及至少5種內(nèi)切葡聚糖酶（Cel5A、Cel7B、Cel12A、Cel45A和Cel61A），并且這些酶可以相互協(xié)同作用，水解纖維素[29-30]；白曲霉（）編碼的GH61家族的內(nèi)切葡聚糖酶AkCel61及截?cái)囿wrAkCel61ΔCBM對(duì)海帶多糖及可溶性羧甲基纖維素具有一定的水解能力，但對(duì)微晶纖維素、阿拉伯木聚糖和果膠等多糖沒有水解能力[31]。水稻白葉枯病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae）分泌的木聚糖酶XynB能夠增強(qiáng)病原菌對(duì)水稻的致病力[32]。【本研究切入點(diǎn)】盡管碳水化合物活性酶的酶解活性及功能的多樣性在不同真菌中被廣泛報(bào)道，但是這些酶類在葡萄潰瘍病菌中的作用機(jī)理并不清楚。筆者研究室在前期工作中完成了葡萄潰瘍病菌3個(gè)種可可毛色二孢、葡萄座腔菌及小新殼梭孢的全基因組測(cè)序、數(shù)據(jù)拼接及基因功能注釋[21]。在致病力最強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)種可可毛色二孢預(yù)測(cè)的12 902個(gè)蛋白編碼基因中，有820個(gè)基因的編碼產(chǎn)物為碳水化合物活性酶類，其中198個(gè)是可可毛色二孢特有的，但是關(guān)于這些碳水化合物活性酶的功能未見報(bào)道。以可可毛色二孢中一個(gè)碳水化合物活性酶為研究對(duì)象，氨基酸序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明該蛋白酶屬于糖苷水解酶61（GH61）家族，命名為L(zhǎng)tGH61A，但是關(guān)于該蛋白的外泌特性、生物學(xué)功能及其在病原菌侵染寄主不同階段的基因表達(dá)模式并不清晰。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用RNAi及病原菌接種研究LtGH61A對(duì)可可毛色二孢致病力的影響；通過酵母互補(bǔ)試驗(yàn)分析LtGH61A蛋白的信號(hào)肽活性；通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）比較在營(yíng)養(yǎng)菌絲及病原菌侵染各階段的表達(dá)量差異。明確LtGH61A蛋白的外泌特性及其在可可毛色二孢致病中的作用，為后續(xù)深入解析LtGH61A蛋白的作用機(jī)理打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年11月至2019年6月在北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所進(jìn)行。

1.1 材料

供試菌株及植物：可可毛色二孢野生型（WT）菌株CSS-01s由筆者實(shí)驗(yàn)室保存，酵母菌株YTK12由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)孫文獻(xiàn)老師饋贈(zèng)，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。病原菌接種試驗(yàn)所用葡萄品種為‘夏黑’，順義香逸葡萄園。真菌轉(zhuǎn)化子置于滅菌的1.5 mL Eppendorf管中，保存于4℃冰箱，質(zhì)粒載體保存于-20℃冰箱。

供試藥劑及儀器：各種限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶，New England Biolabs公司；高保真聚合酶，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素、硫酸腺嘌呤，北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗霉素A，Abcam公司，英國(guó)；聚乙二醇3350及棉子糖，Sigma-aldrich公司，美國(guó)；Trizon試劑，Invitrogen，美國(guó)；植物RNA快速提取試劑盒，北京艾德萊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×RealStar Green Fast Mixture with ROX II，北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；酵母提取物、蛋白胨、不含氨基酸的酵母氮源、瓊脂，Becton, Dickinson and Company，美國(guó)；YeastmakerTMYeast Transformation System 2試劑盒、tryptophan dropout supplement，Clonthch，日本；Applied Biosystems 7500儀器，ABI公司，美國(guó)；冷凍高速離心機(jī)，HiKOKI，日本。

培養(yǎng)基：60% PEG3350（120 g聚乙二醇3350溶解于ddH2O，定容至120 mL）；YPDA培養(yǎng)基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、0.003%硫酸腺嘌呤，固體培養(yǎng)基按比例加2%瓊脂）；CMD-W（0.67%不含氨基酸的酵母氮源、0.075% tryptophan dropout supplement、2%蔗糖、0.1%葡萄糖和2%瓊脂）；YPRAA培養(yǎng)基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%棉子糖、2 μg·mL-1抗霉素A、2%瓊脂）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄枝干的離體接種 選取一年生葡萄感病品種‘夏黑’，在葡萄莖稈上用直徑4 mm的打孔器劃取大小一致的傷口，然后在生長(zhǎng)2 d的可可毛色二孢菌落邊緣，用直徑4 mm的打孔器打取直徑一致的菌餅，并將其接種至葡萄傷口處，25℃、光照和黑暗各12 h交替保濕培養(yǎng)。3 d后觀察發(fā)病情況，測(cè)量統(tǒng)計(jì)病斑長(zhǎng)度。

1.2.2 葡萄枝干RNA的提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄 通過離體接種的方法，將可可毛色二孢菌塊接種至葡萄枝干傷口處，然后分別在接種病菌后24、48、72 h，截取葡萄枝干的發(fā)病部位，-80℃液氮速凍。采用植物RNA快速提取試劑盒提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。獲得的cDNA模板用于后續(xù)的基因克隆及表達(dá)量分析。

1.2.3 可可毛色二孢原生質(zhì)體的制備 將可可毛色二孢CSS-01s接種至CM固體平板上，生長(zhǎng)約24 h；將菌絲轉(zhuǎn)移至液體CM培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min搖培24 h；將搖培好的菌絲置于50 mL離心管中，4 000 r/min離心5 min，收集沉淀的菌絲；稱量菌絲的質(zhì)量，按照每克菌絲加入2 mL 2%的蝸牛酶及2%崩潰酶的比例，加入適量的裂解酶，28℃、160 r/min酶解4 h；然后用內(nèi)置4層濾紙的漏斗過濾酶解完的菌絲，并用0.7 mol·L-1的氯化鈉洗脫，4℃、4 000 r/min離心15 min，收集原生質(zhì)體；收集原生質(zhì)體沉淀，用5 mL STC溶液懸浮洗滌，4℃、4 000 r/min離心15 min；加入適量的STC溶液，懸浮原生質(zhì)體，并將其終濃度調(diào)整為約1×107個(gè)/mL，制備的原生質(zhì)體用于轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

1.2.4 可可毛色二孢原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 將準(zhǔn)備好的可可毛色二孢原生質(zhì)體及RNAi質(zhì)?；靹蛴?0 mL離心管中，放置在冰上，10 min；往混合物中滴加2 mL PEG3350溶液，至于冰上15 min；然后加入30 mL STC溶液，上下顛倒混勻，4℃、4 000 r/min離心15 min；離心得到的原生質(zhì)體沉淀采用LR培養(yǎng)基懸浮，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；培養(yǎng)約12 h后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，每皿加入約12 mL 固體LR培養(yǎng)基混勻，待其凝固后，上面鋪一層10 mL的水瓊脂培養(yǎng)基（含1 100 μg·mL-1新霉素）；28℃培養(yǎng)2 d左右，將出現(xiàn)的初始轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)至CM培養(yǎng)基（含1 100 μg·mL-1新霉素）上，連續(xù)篩選3次，然后將對(duì)新霉素抗性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子置于1.5 mL Eppendorf管中，4℃保存。

1.2.5RNAi轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證及其在病原菌侵染不同階段表達(dá)量的檢測(cè) 根據(jù)可可毛色二孢和內(nèi)參基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR的引物（表1）。20 μL PCR反應(yīng)體系：1 μL cDNA、0.4 μL終濃度為0.2 μmol·L-1基因特異性引物、10 μL 2×RealStar Green Fast Mixture（with ROX II），補(bǔ)水至總體系為20 μL。PCR反應(yīng)程序采用兩步法：預(yù)變性95℃ 2 min；變性95℃ 15 s，退火延伸60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。得到的CT值取平均值，根據(jù)2-ΔΔCT值計(jì)算不同侵染階段基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6融合載體的構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化 YTK12是一個(gè)蔗糖酶外泌缺陷型酵母，該酵母已被廣泛用于分析鑒定分泌蛋白的信號(hào)肽[33-34]。通過Signal IP 4.0預(yù)測(cè)LtGh61A蛋白N端包含一個(gè)長(zhǎng)度為18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列LtGh61ASP，將編碼LtGh61ASP的核酸序列連接至缺失信號(hào)肽序列的蔗糖酶編碼基因序列上游，構(gòu)建融合表達(dá)載體。采用YeastmakerTMYeast Transformation System 2試劑盒，將、陽性對(duì)照載體及陰性對(duì)照載體分別轉(zhuǎn)入酵母YTK12菌株中，在CMD-W培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3 d左右，篩選轉(zhuǎn)化子。將在CMD-W平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子劃線至YPRAA平板上，通過觀察酵母轉(zhuǎn)化子在YPRAA平板上的生長(zhǎng)狀況，檢測(cè)LtGH61A蛋白的信號(hào)肽序列是否具有外泌特性。同時(shí)，將轉(zhuǎn)化子劃線至CMD-W及YPDA平板上，用作試驗(yàn)對(duì)照。

表1 本試驗(yàn)所用引物

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2013進(jìn)行差異顯著性分析，圖片應(yīng)用Excel 2013及Adobe Photoshop CS5軟件制作。

2 結(jié)果

2.1 LtGH61A蛋白信號(hào)肽的鑒定

將與陽性對(duì)照載體及陰性對(duì)照載體分別轉(zhuǎn)入酵母YTK12菌株后，獲得的轉(zhuǎn)化子在YPARR培養(yǎng)基上劃線，3 d后的生長(zhǎng)結(jié)果顯示表達(dá)和陽性對(duì)照的酵母均能夠在YPARR培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這表明LtGH61A蛋白的信號(hào)肽和大豆疫霉（）外泌蛋白Avr1b的信號(hào)肽均能夠引起酵母YTK12蔗糖酶的外泌，進(jìn)而分解YPRAA培養(yǎng)基中的棉子糖，從而獲得自身生長(zhǎng)需要的碳源。與此同時(shí)，陰性對(duì)照的表達(dá)產(chǎn)物不能分泌至胞外，因此不能利用YPRAA培養(yǎng)基中的碳源。此外，酵母轉(zhuǎn)化子在YPDA及CMD-W培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)作為對(duì)照（圖1）。

2.2 LtGH61A RNAi轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

將測(cè)序正確的RNAi載體轉(zhuǎn)入可可毛色二孢的原生質(zhì)體，長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子經(jīng)3輪連續(xù)的抗性篩選后，選擇2株抗性遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，分別命名為RNAi-LtGh61A1和RNAi-LtGH61A2，用于檢測(cè)表達(dá)量。qRT-PCR結(jié)果顯示，與野生型相比，轉(zhuǎn)化子RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2中的表達(dá)量顯著降低，說明在這2株轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)得到抑制（圖2）。

圖1 不同酵母轉(zhuǎn)化子在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

**：P＜0.01

2.3 LtGH61A對(duì)可可毛色二孢生長(zhǎng)及致病力的影響

為了觀察對(duì)可可毛色二孢生長(zhǎng)速率的影響，將直徑為4 mm的野生型CSS-01s，RNAi轉(zhuǎn)化子RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2分別點(diǎn)接至CM培養(yǎng)基平板中央，生長(zhǎng)2 d后拍照，比較野生型和RNAi轉(zhuǎn)化子菌絲生長(zhǎng)速率的差異。測(cè)量結(jié)果表明，與野生型CSS-01s相比，RNAi轉(zhuǎn)化子RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2的菌絲生長(zhǎng)速率明顯降低，菌落直徑為野生型的85%左右（圖3-A、3-B）。

為了分析對(duì)可可毛色二孢菌致病力的影響，將野生型CSS-01s，RNAi轉(zhuǎn)化子RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2分別接種葡萄枝干，比較野生型和RNAi轉(zhuǎn)化子在葡萄枝干上引起的病斑長(zhǎng)度差異。結(jié)果表明，與野生型CSS-01s相比，RNAi轉(zhuǎn)化子RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2侵染葡萄枝干形成病斑的長(zhǎng)度顯著變短，約為野生型的55%（圖3-C、3-D），對(duì)葡萄枝干的致病力明顯減弱，進(jìn)一步證實(shí)影響可可毛色二孢的致病力。

2.4 LtGH61A在病原菌侵染寄主不同階段的表達(dá)量

為了明確在病原菌營(yíng)養(yǎng)菌絲及侵染過程中的表達(dá)模式，通過qRT-PCR檢測(cè)在不同階段的表達(dá)量。結(jié)果表明，與營(yíng)養(yǎng)菌絲階段相比，在病原菌侵染階段的表達(dá)量明顯升高（圖4）。說明LtGH61A作為一個(gè)重要的致病因子，在病菌侵染致病階段發(fā)揮了更加重要的作用。

A：菌落形態(tài)The colony morphology；B：菌落直徑比較 Statistical analysis of the colony diameter；C：在葡萄枝干上形成的病斑The lesion on grape shoot；D：病斑長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)Statistical analysis of the lesion length。**：P＜0.01

VH：營(yíng)養(yǎng)菌絲vegetative hyphae；24—72 h：接種后24、48、72 h 24, 48 and 72 h after inoculation。**：P＜0.01

3 討論

葡萄潰瘍病菌作為重要的木本植物病原真菌，近年來由于其危害的嚴(yán)重性及侵染寄主的廣泛性，該病原菌日漸受到人們的關(guān)注，但是目前該病原菌的致病機(jī)制并不清晰。筆者研究室先后在國(guó)內(nèi)率先分離鑒定了6個(gè)種的葡萄潰瘍病菌，完成了其中3個(gè)種可可毛色二孢、葡萄座腔菌及小新殼梭孢的全基因組及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)拼接，并分析預(yù)測(cè)了優(yōu)勢(shì)種可可毛色二孢中近800個(gè)碳水化合物活性酶，包括糖苷水解酶GHS、糖基轉(zhuǎn)移酶GTS、糖水化合物酯酶類CES、碳水化合物結(jié)合模塊CBMS和輔助模塊酶類AAS等，其中大量的碳水化合物活性酶編碼基因在病原菌侵染階段上調(diào)表達(dá)，但是其作用機(jī)制仍不清晰[21]。本研究以其中一個(gè)碳水化合物活性酶LtGH61A為研究對(duì)象，RNAi結(jié)合病原菌接種結(jié)果表明，的下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致可可毛色二孢的致病力明顯減弱，這與前期超表達(dá)該基因能增強(qiáng)可可毛色二孢的致病力這一結(jié)果一致[21]；此外，的下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致可可毛色二孢的菌絲生長(zhǎng)速率減慢（圖3-A、3-B），由此說明LtGH61A是可可毛色二孢菌無性發(fā)育及侵染致病的重要影響因子，這為后續(xù)深入解析LtGH61A作用的分子機(jī)理打下了基礎(chǔ)。

LtGH61A蛋白包括231個(gè)氨基酸，經(jīng)SignalP 4.0預(yù)測(cè)其N端包含一個(gè)長(zhǎng)度為18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，酵母YTK12是一個(gè)蔗糖酶外泌缺陷型酵母，該體系已被廣泛應(yīng)用于稻曲病菌（）[34]、葡萄霜霉菌（）[35]、條銹病菌（）[36]、大豆疫霉[37]等病原菌外泌蛋白信號(hào)肽的鑒定。本研究應(yīng)用該酵母體系，發(fā)現(xiàn)LtGH61A蛋白的信號(hào)肽同樣能夠引導(dǎo)酵母蔗糖酶的外泌，導(dǎo)致酵母互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子能夠在以棉子糖為碳源的培養(yǎng)基YPRAA上生長(zhǎng)，這表明YTK12酵母體系同樣能夠應(yīng)用于葡萄潰瘍病菌外泌蛋白信號(hào)肽的鑒定。

與Pfam數(shù)據(jù)庫比對(duì)顯示，LtGH61A具有一個(gè)Glyco_hydro_61結(jié)構(gòu)域，屬于糖苷水解酶61（GH61）家族，能夠以纖維素為底物發(fā)揮其酶活功能。關(guān)于GH61家族蛋白酶的功能在不同真菌中已有研究報(bào)道，如嗜熱子囊菌產(chǎn)生的糖苷水解酶TaGH61A能夠以微晶纖維素為底物，發(fā)揮酶解活性[27]。白曲霉編碼的內(nèi)切葡聚糖酶AkCel61對(duì)海帶多糖及可溶性羧甲基纖維素具有一定的水解能力，但是對(duì)微晶纖維素、阿拉伯木聚糖和果膠等多糖沒有水解能力[31]。這些結(jié)果表明不同真菌中產(chǎn)生的GH61家族的糖苷水解酶可能對(duì)纖維素類底物具有一定的水解能力，但是對(duì)具體的纖維素種類具有一定的選擇性。遺憾的是，筆者在試圖探究LtGH61A蛋白酶活功能時(shí)，未能純化出LtGH61A蛋白，以分析LtGH61A蛋白酶解能力及底物。此外，木本植物組織中含有大量的纖維素類物質(zhì)，結(jié)合LtGH61A推定的酶解活性及在病原菌侵染過程中顯著高表達(dá)的特性，推測(cè)葡萄潰瘍病菌在侵染致病過程中，LtGH61A蛋白被病原菌分泌至胞外，以寄主植物中的組織成分為酶解底物，發(fā)揮其酶活功能，以促進(jìn)自身更好地侵染寄主植物。但是LtGH61A作為一個(gè)致病因子，其對(duì)可可毛色二孢侵染致病的影響與其酶解活性是否關(guān)聯(lián)也需要進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

4 結(jié)論

葡萄潰瘍病菌LtGH61A蛋白屬于糖苷水解酶61家族，具有外泌特性，其N端具有一個(gè)信號(hào)肽，能夠引導(dǎo)酵母蔗糖酶的外泌。LtGH61A是葡萄潰瘍病菌一個(gè)重要的致病影響因子，在病原菌侵染階段表達(dá)量升高，并且在侵染后48 h達(dá)到高峰。

致謝：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)孫文獻(xiàn)老師饋贈(zèng)了酵母菌株YTK12及pSUC2載體，在此表示感謝！

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pathogenicity and gene expression pattern of the exocrine protein LtGH61A of grape canker fungus

Peng JunBo, Li XingHong, Zhang Wei, Zhou Ying,HUANG JinBao, Yan JiYe

(Institute of Plant and Environment Protection, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Beijing Key Laboratory of Environmental Friendly Management of Diseases and Pests of North China Fruits, Beijing 100097)

【Objective】Grape canker disease, caused bygenus fungi, occurs in a wide range of grape-producing areas in China and seriously threatens the yield and quality of grape. The objective of this study is to analyze the function of a hypothetical exocrine protein, LtGH61A, in grape canker fungus, and to lay a foundation for in-depth analysis of the pathogenic mechanism and disease control of grape canker fungus.【Method】The signal peptide of LtGH61A protein was predicted by SignalP 4.0. The function of LtGH61A protein was predicted by the homologous comparison and functional annotation. The exocrine characteristic of LtGH61A protein was analyzed by yeast complementary experiment. The quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to analyze the expression ofin vegetative hyphae and different infection processes. The expression ofwas inhibited through RNA interference (RNAi). The effect of LtGH61A protein on the pathogenicity ofwas analyzed byinoculation test of grape shoots. The effect of LtGH61A protein on the hyphal growth rate ofwas analyzed by comparing the colony diameter.【Result】Amino acid sequence analysis predicts that the N-terminal of the LtGH61A protein contains a signal peptide with a length of 18 amino acids. The gene function annotation suggests that LtGH61A belongs to glycoside hydrolase family 61 (GH61) and can degrade cellulose as a substrate. Yeast complementary experiments showed that the signal peptide of LtGH61A protein could guide the secretion of invertase of yeast YTK12. Compared with the vegetative hyphae, the expression ofwas increased significantly at the infectious stages, and the mRNA accumulation ofat 48 h post inoculation was 19 times of that in the vegetative hyphae. Moreover, RNAi lines were constructed forand two lines RNAi-LtGH61A1 and RNAi-LtGH61A2 were confirmed by qRT-PCR. The results ofinoculation test of wild-type and RNAi transformants on wounded grape shoots showed that the lesion length caused by both RNAi-LtGH61A1 and RNAi-LtGH61A2 was significantly shorter than that of wild type (WT) CSS-01s, which was about 55% of WT, indicating that LtGH61A affected the pathogenicity of. The colony diameter comparison showed that compared with WT, the colony diameter of RNAi-LtGH61A1 and RNAi-LtGH61A2 transformants became smaller, about 85% of WT, indicating that LtGH61A affected the hyphal growth rate of.【Conclusion】LtGH61A affects the pathogenicity and hyphal growth of grape canker pathogen. LtGH61A protein can be secreted outside the cell. The expression level ofduring infectious stages is significantly increased, suggesting that LtGH61A can destroy the host plant tissue by exerting its own enzyme activity function, thus promoting pathogen infection.

grape canker fungus; exocrine protein; pathogenicity; expression pattern; qRT-PCR; RNA interference (RNAi)

2019-06-24；

2019-07-18

北京市青年拔尖個(gè)人項(xiàng)目（2016000021223ZK29）、北京市農(nóng)林科學(xué)院院儲(chǔ)備項(xiàng)目（KJCX20170412）

彭軍波，E-mail：pjb169961@163.com。通信作者燕繼曄，E-mail：jiyeyan@vip.163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）