李晨，趙雪惠，王慶杰，王旭旭，肖偉，陳修德，付喜玲，李玲，李冬梅

桃家族全基因組鑒定與響應(yīng)UV-B的表達(dá)模式分析

李晨，趙雪惠，王慶杰，王旭旭，肖偉，陳修德，付喜玲，李玲，李冬梅

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東泰安 271018）

【目的】基因家族成員在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過(guò)生物信息學(xué)分析在桃基因組中的分布、結(jié)構(gòu)及進(jìn)化，研究家族成員在不同組織中的表達(dá)特異性及其對(duì)UV-B的響應(yīng)，解析基因家族的生物學(xué)功能?！痉椒ā繉?duì)設(shè)施油桃‘中油5號(hào)’（var.cv. Zhongyou5）補(bǔ)充適量UV-B（Ultraviolet-B）劑量，利用Plant TFDB數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定桃基因家族成員。采用Clustal W、MEGA6.0、ProtParam tool、MCScanX、Circos、SMART、NCBI-CDD、ExPASy、GSDS和MEME等軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，繪制染色體定位圖，預(yù)測(cè)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量與等電點(diǎn)等理化性質(zhì)等，分析基因家族成員在不同組織中的表達(dá)模式，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)桃在UV-B處理下的表達(dá)情況。【結(jié)果】從桃全基因組中鑒定出48個(gè)GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族基因，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)將這48個(gè)成員分為9個(gè)亞家族，在桃的8條染色體上呈不均勻分布。對(duì)基因家族進(jìn)行理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白平均長(zhǎng)度為590.52 aa，等電點(diǎn)在4.36—7.56。家族基因結(jié)構(gòu)分析表明，有40個(gè)基因不含內(nèi)含子，8個(gè)基因含有1個(gè)內(nèi)含子。保守元件分析顯示，家族包含20個(gè)保守元件，其中Motif 2和4在的家族中高度保守，同一個(gè)亞家族成員含有相同的保守元件，其可能具備相似的功能。然而，有些亞家族成員的表達(dá)模式不同，這可能與其保守基序之外的序列有關(guān)。在不同組織中具有不同的表達(dá)模式。葉片中經(jīng)UV-B處理后上調(diào)表達(dá)最顯著，而有多達(dá)15個(gè)基因表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)。果實(shí)中經(jīng)UV-B處理后上調(diào)表達(dá)，但有9個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。韌皮部中，UV-B處理后有14個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，而經(jīng)處理后在韌皮部中表達(dá)下調(diào)最明顯?！窘Y(jié)論】從桃基因組中共鑒定出48個(gè)GRAS基因家族成員，分布于8條染色體上；多數(shù)能響應(yīng)UV-B處理，但在不同組織中的表達(dá)不盡相同。

桃；基因家族；生物信息學(xué)分析；UV-B

0 引言

【研究意義】桃是中國(guó)北方的主栽果樹(shù)之一，隨著果樹(shù)集約化栽培的推行，設(shè)施桃栽培得到了迅速發(fā)展。然而與露天栽培相比，設(shè)施栽培果樹(shù)表現(xiàn)出果實(shí)甜度變低、風(fēng)味偏淡、綜合品質(zhì)下降等問(wèn)題，棚膜吸收、反射太陽(yáng)光導(dǎo)致設(shè)施內(nèi)UV-B弱化是重要的影響因素之一[1]。基因家族成員在植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、GA信號(hào)調(diào)節(jié)和腋芽分生組織形成等[2]。對(duì)桃基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析、組織特異性表達(dá)及響應(yīng)UV-B處理的表達(dá)模式分析，有利于深入了解家族基因的潛在功能，并對(duì)桃響應(yīng)UV-B光信號(hào)的基因挖掘具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自20世紀(jì)80年代后期，人類(lèi)活動(dòng)造成了臭氧層空洞，而臭氧量的減少導(dǎo)致到達(dá)地表的UV-B輻射增強(qiáng)。UV-B是紫外線(xiàn)中的中波輻射（280—320 nm），約占太陽(yáng)輻射總量的1.5%。其能量高，且能被核酸、蛋白質(zhì)及脂類(lèi)等物質(zhì)吸收。研究表明UV-B具有損傷DNA、改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；破壞光合作用；造成植株矮化、株型縮小，生長(zhǎng)受抑制等負(fù)作用，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和動(dòng)、植物生長(zhǎng)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[1,3-4]。事實(shí)上，UV-B對(duì)植物的影響效應(yīng)具有雙重性，高UV-B輻射對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響，低劑量的UV-B在基因表達(dá)、代謝活動(dòng)以及生長(zhǎng)發(fā)育等方面反而會(huì)起到正面的調(diào)節(jié)作用[5-6]。UV-B輻射是應(yīng)激源還是調(diào)節(jié)器與其輻射強(qiáng)度和時(shí)間有關(guān)[7]。設(shè)施條件下的UV-B強(qiáng)度較露天弱，葉片中紫外吸收物質(zhì)較露天少，補(bǔ)充UV-B后含量總體得到提升[8]。比較紫外線(xiàn)敏感品種‘旭日’和不敏感品種‘朝陽(yáng)’葉片中的類(lèi)黃酮含量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)較高強(qiáng)度UV-B輻射后，前者類(lèi)黃酮含量先升高后降低，變化明顯，后者則相對(duì)穩(wěn)定，表明朝陽(yáng)更能有效適應(yīng)UV-B強(qiáng)度的增加[7]。光受體UV RESISTANCE LOCUS8（UVR8）被發(fā)現(xiàn)后，UV-B由環(huán)境脅迫因子變成了特殊的信號(hào)調(diào)控因子[1]，其在光感受中具有獨(dú)特的調(diào)節(jié)機(jī)制[9-10]。在UV-B處理后，UVR8能與下游多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而啟動(dòng)光形態(tài)發(fā)生[11]。長(zhǎng)時(shí)間以較低UV-B劑量照射作物，并未發(fā)現(xiàn)ROS積累及其編碼基因的表達(dá)，反而會(huì)啟動(dòng)UVR8信號(hào)通路，引起良性應(yīng)激，但UV-B劑量超出作物承受范圍時(shí)會(huì)引起破壞性應(yīng)激[12]。更有研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)植物在UV-B輻射下表現(xiàn)出植株形態(tài)、生理生化和激素等各個(gè)方面的變化[1]。轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮尤為重要的作用?；蚣易逋ǔ１徽J(rèn)為是植物特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族[13]，能夠響應(yīng)激素、光等多種信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。GRAS蛋白質(zhì)由可變的N末端和高度保守的C末端組成，其被稱(chēng)為GRAS結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域主要由兩個(gè)亮氨酸七肽重復(fù)序列（LHRI和LHRII）組成的VHIID、PFYRE和SAW共3個(gè)基序組成[14-15]。在擬南芥中，將GRAS家族蛋白分為8個(gè)亞家族：DELLA、LS、SCR、SHR、PAT1、HAM、SCL9（LISCL）和SCL4/7[14]。而在水稻中[15]也認(rèn)為可能會(huì)分為8個(gè)亞科，但包括一個(gè)新的亞家族SCL3，而不是SCL4/7。葡萄中GRAS家族蛋白序列也分成了8個(gè)亞家族，且其氨基酸序列主要為-螺旋和隨機(jī)卷曲，其三維結(jié)構(gòu)相似[16]。擬南芥、水稻和其他植物種類(lèi)的GRAS蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，其具有12個(gè)獨(dú)立的分支[17]，這些研究表明該基因家族在植物中表現(xiàn)出多樣化。其中，DELLA亞家族成員參與了擬南芥中的赤霉酸信號(hào)傳導(dǎo)[18]，葡萄中/可能響應(yīng)GA負(fù)調(diào)控參與無(wú)核果實(shí)的發(fā)育[19]，亞家族成員在番茄的腋芽分生組織中起作用[20]，亞家族成員、維持了擬南芥頂端分生組織的屬性與更新[17,21]，分支中的和作為光敏色素信號(hào)通路的中間介質(zhì)發(fā)揮作用[22]，亞家族成員對(duì)促進(jìn)擬南芥的根細(xì)胞伸長(zhǎng)起作用[23]。Ma等[24]證明在胡楊中過(guò)量表達(dá)（亞家族）增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性和耐鹽性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前在模式植物擬南芥中，對(duì)基因家族的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化、相互作用機(jī)理以及抵御逆境等方面的研究較為深入。然而，在木本植物特別是果樹(shù)中該家族基因的系統(tǒng)報(bào)道較少，桃基因家族成員響應(yīng)UV-B光信號(hào)的功能有待進(jìn)一步研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以設(shè)施栽培的‘中油5號(hào)’油桃的葉片、果實(shí)和韌皮部為研究材料，對(duì)家族中的48個(gè)成員進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在了解其基本理化性質(zhì)、家族分類(lèi)、保守結(jié)構(gòu)域以及基因結(jié)構(gòu)等；通過(guò)檢測(cè)基因家族成員在UV-B處理后的葉片、果實(shí)和韌皮部中的表達(dá)水平，了解家族的基因性質(zhì)，篩選該家族中可能響應(yīng)UV-B光信號(hào)的重要基因。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

試材為7年生設(shè)施油桃‘中油5號(hào)’（var.cv. Zhongyou5）。自開(kāi)花至果實(shí)成熟期間，用1.44 kJ·m-2·d-1UV-B照射處理植株（此劑量由前期試驗(yàn)篩選得出）。UV-B由專(zhuān)用LED UV-B燈（40 W，297 nm，南京Kazhi）提供，懸掛在樹(shù)體上方1.5 m處，通過(guò)電子自動(dòng)控制裝置控制紫外燈的開(kāi)/關(guān)時(shí)間，每天上午9:30—10:30補(bǔ)充1 h，陰雨天和下雪天停止照射。使用配備有297 nm探針的UV-B型單通道UV輻照器（北京師范大學(xué)光電儀器廠(chǎng)）測(cè)定燈下80—120 cm范圍內(nèi)的UV-B輻射劑量為1.44 kJ·m-2·d-1，對(duì)該范圍內(nèi)的功能葉（以樹(shù)體外圍一年生枝的生長(zhǎng)點(diǎn)為起始點(diǎn)，倒數(shù)第6—8片葉）、果實(shí)和一年生枝韌皮部進(jìn)行取樣，以相同設(shè)施條件下未進(jìn)行UV-B照射的‘中油5號(hào)’為對(duì)照，3次重復(fù)。液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 數(shù)據(jù)來(lái)源與分析方法

1.2.1 桃的獲取、理化性質(zhì)預(yù)測(cè)與基因染色體定位分析 從Plant TFDB（http://planttfdb.cbi.pku.edu. cn/）下載桃家族數(shù)據(jù)，利用SMART（http://smart. embl-heidelberg.de/）和NCBI-CDD工具進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，檢測(cè)候選蛋白的結(jié)構(gòu)域，去除不含GRAS結(jié)構(gòu)域的序列，篩選候選基因。利用ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）對(duì)所有GRAS家族氨基酸序列進(jìn)行分子量和等電點(diǎn)預(yù)測(cè)。根據(jù)染色體的位置依次命名，利用MCScanX（http://chibba.pgml.uga. edu/mcscan2/）[25]和Circos軟件（http://circos.ca/）[26]繪制桃基因家族成員在染色體上的定位分布。2個(gè)或多個(gè)同源基因在染色體上的物理位置不超過(guò)100 kb即視為串聯(lián)重復(fù)基因[27]。

1.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、結(jié)構(gòu)域分析及基因結(jié)構(gòu)分析 參照Nakano等[28]的分類(lèi)方法，將擬南芥與桃家族成員的蛋白序列用Clustal W進(jìn)行多重序列比對(duì)后導(dǎo)入進(jìn)化樹(shù)分析軟件MEGA 6.0，采用相鄰連接法（neighbor-joining NJ；執(zhí)行參數(shù)：Bootstrap method 1000，Poisson model，Pairwise deletion）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)桃GRAS蛋白進(jìn)行亞族分類(lèi)。利用MEME（http://me-me-suite.org/index.html）對(duì)桃保守域結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用GSDS online（http://gsds.cbi. pku.edu.cn/）預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)。

1.3 總RNA的提取和qRT-PCR

使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根，Cat No.DP441）提取液氮凍樣的RNA，利用HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒（Vazyme公司，中國(guó)）合成cDNA第一鏈。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，用cDNA模板檢測(cè)各基因表達(dá)水平，利用Primer 3.0設(shè)計(jì)熒光定量引物，引物序列見(jiàn)表1，內(nèi)參為桃-Actin，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix（Vazyme）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。qRT-PCR反應(yīng)體系為：10.0 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，上、下游引物分別為0.4 μL（10 μmol·L-1），1.0 μL模板，8.2 μL ddH2O。每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，繪制溶解曲線(xiàn)，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。用2-??CT法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。

表1 48個(gè)PpGRAS的qRT-PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，包括單因素方差分析和差異顯著性分析，應(yīng)用GraphPad Prism 6.01軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 桃GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族成員與染色體分布分析

從桃基因組序列中鑒定得到48個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，根據(jù)基因在染色體上的位置，對(duì)所有轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行系統(tǒng)編號(hào)。開(kāi)放式閱讀框長(zhǎng)度在1 218—2 550 bp，蛋白長(zhǎng)度在406—850 aa，平均長(zhǎng)度590.52 aa，分子質(zhì)量在45 828.1—78 010.1 Da，等電點(diǎn)在4.36—7.56，保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，鑒定出的48個(gè)PpGRAS蛋白均具有GRAS特征結(jié)構(gòu)域。桃轉(zhuǎn)錄因子的詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

依據(jù)的染色體位置信息，利用Circos軟件繪制其染色體定位圖。由圖1可知，中有2個(gè)基因（和）無(wú)匹配的染色體定位信息。染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，在桃的8條染色體上呈現(xiàn)不均勻分布，其中第6號(hào)染色體上分布最多，為14個(gè)；其次是第3號(hào)染色體，為7個(gè)；第5和7號(hào)染色體分布最少，均為3個(gè)。由于基因重復(fù)能顯著促進(jìn)基因家族的擴(kuò)展和蛋白質(zhì)功能的多樣化，本研究分析了該基因家族的串聯(lián)重復(fù)。結(jié)果顯示7對(duì)共線(xiàn)GRAS基因（/；；；；；；）和10個(gè)串聯(lián)GRAS基因（；），占總數(shù)的20.83%。共線(xiàn)基因是能通過(guò)復(fù)制在另一基因組以相同連續(xù)順序存在的旁系同源基因，除和外，所有共線(xiàn)都在同一亞家族中。

圖1 桃GRAS家族基因染色體定位及其共線(xiàn)性預(yù)測(cè)

表2 桃GRAS及其相關(guān)信息

2.2 桃GRAS蛋白序列與擬南芥系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的對(duì)比分析

通過(guò)與擬南芥蛋白聚類(lèi)分析，將桃中48個(gè)GRAS蛋白分為9個(gè)亞家族（圖2），這些亞家族是根據(jù)早期研究分類(lèi)[15]或他們中的一名成員在新發(fā)現(xiàn)的亞家族中命名，分別為PAT1、SHR、HAM、LISCL、SCR、LS、DELLA、SCL3、U。每個(gè)亞家族的GRAS成員可能具有相似或相關(guān)的功能。一般而言，大多數(shù)亞家族都擁有來(lái)自2個(gè)物種的GRAS成員（圖2）。然而，在桃中新鑒定出來(lái)的U亞家族不包括任何擬南芥成員，表明擬南芥中譜系特異性基因缺失。LISCL是最大的子家族，包含12個(gè)成員；而在擬南芥中LISCL也是最大的子家族，包含7個(gè)成員；其次是SCL3亞家族，有9個(gè)成員。PpGRAS家族成員共形成8個(gè)旁系同源基因?qū)?，其?對(duì)的自展值為100，而且Prupe.6G073900.1.p/Prupe.6G074000.1.p的自展值為99，U家族僅有的兩個(gè)成員Prupe.3G309800.1.p/Prupe. 8G054000.1.p的自展值達(dá)87。此外，PpGRAS與AtGRAS形成了14個(gè)直系同源基因?qū)Γ渲?2對(duì)的自展值為100（圖2）。

圖2 桃與擬南芥GRAS蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)比對(duì)

2.3 桃GRAS家族保守元件和基因結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)多樣性作為進(jìn)化的可能基礎(chǔ)，可以為多基因家族的進(jìn)化提供有價(jià)值的信息[15,28]?；诿總€(gè)預(yù)測(cè)基因的編碼序列（CDS）和基因組DNA序列分析基因結(jié)構(gòu)（圖3）。桃中家族基因的內(nèi)含子數(shù)量最多為1，其中40個(gè)基因沒(méi)有內(nèi)含子，其余8個(gè)基因（Prupe.2G138400.1.p、Prupe.8G220900.1.p、Prupe. 6G300900.1.p、Prupe.6G073900.1.p、Prupe. 3G040400.1.p、Prupe.8G016200.1.p、Prupe.4G233000.1.p、Prupe. 3G309800.1.p）僅有1個(gè)內(nèi)含子。通常，來(lái)自桃中相同亞家族（SCL3、DELLA和LS）的具有相同的結(jié)構(gòu)。

圖3 桃GRAS結(jié)構(gòu)

為揭示桃中GRAS蛋白質(zhì)的多樣性，進(jìn)一步確定桃家族成員間的關(guān)系，采用MEME預(yù)測(cè)桃家族基因中的元件。從候選的桃GRAS蛋白質(zhì)中共鑒定出20個(gè)保守元件（圖4），并列出了這些保守元件的結(jié)構(gòu)域序列標(biāo)識(shí)（即氨基酸組成）（圖5）。本研究發(fā)現(xiàn)，所有的桃GRAS蛋白都含有Motif 4，表明其在的家族中高度保守；此外，高度保守的Motif 2同樣存在于桃所有GRAS蛋白中。其中motif 2、11在SCL3亞家族成員的N端高度保守，而DELLA亞家族的3個(gè)成員的保守基序表現(xiàn)出較好的一致性，共有10個(gè)保守元件（motif 2、3、4、7、9、15、17、18、19和20），LS亞家族共有8個(gè)保守元件（motif 2、3、4、7、11、15、17和19），HAM亞家族中有5個(gè)共有保守元件（motif 2、4、5、9和19），SCR亞家族中共有7個(gè)保守元件（motif 2、3、4、5、7、9和17），LISCL家族中具有特異性保守元件Motif 13和在其N(xiāo)端高度保守的Motif 16，SHR亞家族中僅有3個(gè)共有保守元件（motif 4、5和17），PAT1亞家族中共有9個(gè)保守元件（motif 2、3、4、5、6、7、9、17和19），U亞家族共有7個(gè)保守元件（motif 2、3、4、5、9、17和19）。由此發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中密切相關(guān)的含有相同的保守元件，而且有的亞家族中具備專(zhuān)有的保守元件，表明同一個(gè)亞家族的基因具備相似的功能。從桃的基因結(jié)構(gòu)和保守元件位置分析，確定大多數(shù)成員在各個(gè)亞家族中是保守的。

圖4 桃GRAS基因家族保守元件

圖5 桃GRAS結(jié)構(gòu)域的序列標(biāo)識(shí)

2.4 桃GRAS家族基因的組織特異性表達(dá)分析及其對(duì)UV-B的響應(yīng)

家族基因在葉片、果實(shí)和韌皮部中的組織特異性分析如圖6-A所示。48個(gè)在葉片、果實(shí)和韌皮部3種組織中均有表達(dá)，表達(dá)模式存在一定的差異。33.33%的基因（16個(gè)）在葉片中的表達(dá)量高于其余兩種組織。、和在桃韌皮部中高度表達(dá)；、、和在果實(shí)中的表達(dá)最高。UV-B處理后48個(gè)基因在3個(gè)組織中也均有表達(dá)，其表達(dá)模式與CK不盡相同。其中，和在葉片中的表達(dá)量高于其他組織；和在桃韌皮部中高表達(dá)；而有25個(gè)基因在果實(shí)中的表達(dá)量低于其他組織。并且，有8個(gè)基因（和）在3個(gè)組織中的表達(dá)水平基本一致。

響應(yīng)UV-B信號(hào)的在不同組織內(nèi)的表達(dá)量與CK的比值見(jiàn)圖6-B。在葉片中，和在UV-B處理后上調(diào)表達(dá)，而31.25%的基因（15個(gè)）表達(dá)量下調(diào)。在果實(shí)中，經(jīng)UV-B處理后上調(diào)表達(dá)，而有9個(gè)基因（和）下調(diào)表達(dá)。在韌皮部中，UV-B處理后有29.17%的基因（14個(gè)）上調(diào)表達(dá)，而和經(jīng)處理后表達(dá)下調(diào)。另外，有7個(gè)基因（和）經(jīng)UV-B處理后在各個(gè)組織內(nèi)均未表現(xiàn)出明顯變化。

3 討論

3.1 PpGRAS轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定和分析

是涉及植物生長(zhǎng)和發(fā)育等各方面重要的轉(zhuǎn)錄因子。基因家族在植物中廣泛分布，且家族成員的數(shù)量與基因組的大小無(wú)關(guān)[21]。植物體在生物進(jìn)化過(guò)程中主要通過(guò)基因組的廣泛復(fù)制和多樣化，產(chǎn)生基因家族中的多成員[29-30]。在擬南芥中，家族發(fā)生了2次串聯(lián)重復(fù)事件[2]。而且，基因家族的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象在番茄、水稻、白楊和辣椒等物種中均被檢測(cè)到[2,21,31]。本研究鑒定出48個(gè)基因家族成員，低于水稻（57個(gè)）[15]、辣椒（58個(gè)）[21]和番茄（53個(gè)）[32]等作物，可能是由于桃基因組中沒(méi)有大規(guī)模的片段復(fù)制，且相對(duì)保守等原因造成的。通過(guò)染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，在桃基因組中廣泛分布，且存在明顯的串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，串聯(lián)重復(fù)基因占20.833%（10/48），這表明串聯(lián)重復(fù)在基因家族擴(kuò)增和進(jìn)化中起著重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，水稻中的一些GRAS蛋白質(zhì)并未找到合適的亞家族[2]，本研究發(fā)現(xiàn)，在桃家族中同樣有兩個(gè)基因（）在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析中不屬于已知的8個(gè)亞家族，而且其可靠性達(dá)87，將其劃分為U亞家族，因而將桃中共劃分為9個(gè)亞家族[15]。該U亞家族成員基因的表達(dá)有所差異，其中在果實(shí)中表達(dá)較低，而在果實(shí)和韌皮部中表達(dá)都較低；UV-B處理后的表達(dá)基本不受影響，但的表達(dá)在韌皮部中上調(diào)。而DELLA、LISCL和PAT1亞家族的基因結(jié)構(gòu)具有明顯的一致性，表明這些亞家族的基因具備更為相似的功能。而且還發(fā)現(xiàn)LISCL和PAT1亞家族的基因表達(dá)模式同樣具有明顯的特異性，主要在葉中表達(dá)。但是有些亞家族內(nèi)基因的表達(dá)模式有所不同，可能參與了不同的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。推測(cè)同一亞家族之間不同的表達(dá)差異可能與保守基序外的序列有關(guān)。此外，基因表達(dá)模式的研究可為家族基因的功能驗(yàn)證提供依據(jù)?；蚣易宓南到y(tǒng)發(fā)育分析為進(jìn)一步研究桃的功能基因組提供了理論基礎(chǔ)。

3.2 PpGRAS響應(yīng)UV-B處理的表達(dá)分析

GRAS蛋白在多種植物中被發(fā)現(xiàn)，功能呈多樣性，并在不同品種、不同組織和不同生長(zhǎng)階段所發(fā)揮的作用不盡相同[2,32]。目前，模式植物擬南芥的基因家族中的多個(gè)亞家族成員的功能已被驗(yàn)證[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，設(shè)施桃葉片、果實(shí)和韌皮部3個(gè)組織中均有多個(gè)響應(yīng)UV-B處理，響應(yīng)情況不盡相同。

3.2.1桃葉片中響應(yīng)UV-B光信號(hào)的表達(dá)分析 DELLA蛋白作為負(fù)調(diào)控因子參與了GA信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。當(dāng)DELLA蛋白接收GA信號(hào)時(shí)，會(huì)迅速降解，植株表現(xiàn)正常的GA響應(yīng)程序[23]，而突變體植株卻表現(xiàn)出GA不敏感表型[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，作為DELLA亞家族成員中同源基因，在UV-B處理后，在葉片中上調(diào)表達(dá)最為顯著。有研究表明，在桃上進(jìn)行UV-B處理后造成了葉片中內(nèi)源赤霉素含量降低[34]。由此推測(cè)，UV-B處理后可能導(dǎo)致葉片中內(nèi)源赤霉素含量降低，又經(jīng)由GA信號(hào)調(diào)控了，從而使其上調(diào)表達(dá)。

矮牽牛中主要在側(cè)生器官原基和莖原維管組織中表達(dá)，對(duì)維持莖尖分生組織活性發(fā)揮了重要作用。矮牽牛突變體植株的葉片數(shù)明顯減少，莖尖分生組織喪失分化特性，阻止了器官的形成[35]。而本研究發(fā)現(xiàn)，桃HAM亞家族成員經(jīng)UV-B處理后在葉片中表達(dá)下調(diào)最為明顯，推測(cè)其可能響應(yīng)UV-B處理后對(duì)葉片的葉原基分化起著重要作用，具體功能尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2.2桃果實(shí)中響應(yīng)UV-B光信號(hào)的表達(dá)分析 遠(yuǎn)紅光、紅光和白光配合處理都降低了的轉(zhuǎn)錄水平，而且與SCL21相互作用的PAT1蛋白主要參與了phy A介導(dǎo)的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，在光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，作為PAT1亞家族中的同源基因，經(jīng)UV-B處理后在果實(shí)中顯著下調(diào)表達(dá)，表明基因家族成員在響應(yīng)UV-B光信號(hào)中也可能發(fā)揮了重要作用。

作為桃SCR亞家族的成員，在桃果實(shí)中經(jīng)UV-B處理后上調(diào)表達(dá)最為顯著。SHR和SCR蛋白的作用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂過(guò)程的缺陷[36]，相似結(jié)果也在水稻[37]和玉米[38]中發(fā)現(xiàn)；而且不僅參與了根的發(fā)育調(diào)控，同時(shí)也參與了葉片保衛(wèi)細(xì)胞的形成[39]。陳麗華等[40]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GA處理后的‘無(wú)核白雞心’葡萄的果形明顯拉長(zhǎng)，而且在GA處理后呈現(xiàn)整體性的上調(diào)表達(dá)，可能在響應(yīng)GA處理后調(diào)控了葡萄果實(shí)細(xì)胞的分裂和分化。因而，推測(cè)可能具有響應(yīng)UV-B光信號(hào)調(diào)控桃果實(shí)縱、橫徑的功能。

3.2.3桃韌皮部中響應(yīng)UV-B光信號(hào)的表達(dá)分析 在擬南芥根部，SCL3能作為GAI和RGA的衰減子調(diào)控伸長(zhǎng)區(qū)和分化區(qū)細(xì)胞的伸長(zhǎng)，SCL3-DELLA互作調(diào)節(jié)的GA信號(hào)途徑，能與SHR/SCR途徑聯(lián)合調(diào)控分裂區(qū)基本組織的分裂時(shí)間和程度[23]。相似的結(jié)論同樣出現(xiàn)在毛竹中[39]。本研究發(fā)現(xiàn)，SCL3亞家族成員在韌皮部中經(jīng)UV-B處理后下調(diào)表達(dá)最為明顯，推測(cè)可能負(fù)響應(yīng)UV-B光信號(hào)，減弱對(duì)桃韌皮部細(xì)胞分裂程度的抑制。

果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，如果基因在幼果期的表達(dá)水平高于成熟期，則其可能在果實(shí)前期發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要功能。黃偉[32]研究發(fā)現(xiàn)，番茄中的表達(dá)在果實(shí)轉(zhuǎn)色期有顯著上升，其可能對(duì)啟動(dòng)果實(shí)成熟具有重要作用。而本研究發(fā)現(xiàn)，作為的同源基因，經(jīng)UV-B處理后在韌皮部中上調(diào)表達(dá)最為明顯，說(shuō)明其可能在“源-庫(kù)”間有機(jī)物的運(yùn)輸中起著重要作用。

4 結(jié)論

通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)出48個(gè)桃基因家族成員，分為9個(gè)亞家族，基因結(jié)構(gòu)、染色體分布和保守元件分布等多種生信分析表明這些基因在進(jìn)化過(guò)程中比較保守。采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)桃基因家族成員進(jìn)行組織特異性分析，發(fā)現(xiàn)48個(gè)基因在葉片、果實(shí)和韌皮部中均有表達(dá)，但表達(dá)變化不盡相同。本研究還探索了基因家族成員對(duì)UV-B的響應(yīng)模式，發(fā)現(xiàn)多數(shù)能響應(yīng)UV-B處理，表明基因家族可能在光響應(yīng)方面發(fā)揮著多種潛在功能。

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Genome Identification ofFamily and Expression Pattern Analysis of Responding to UV-B in Peach

LI Chen, ZHAO XueHui, WANG QingJie, WANG XuXu, XIAO Wei, CHEN XiuDe, Fu XiLing, LI Ling, LI DongMei

(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology/Shandong Collaborative Innovation Center for Fruit & Vegetable Production with High Quality and Efficiency, Taian 271018, Shandong)

【Objective】transcription factor family genes play a key role in the regulation of plant growth and development. The objectives of this study were to analyze the distribution, structure and evolution ofin the peach genome by bioinformatics, to study the expression specificity of family members in different tissues and their responses to UV-B optical signal, and to investigate the biological function oftranscription factor family genes in peach. 【Method】The facility nectarine ‘var.cv. Zhongyou5 was supplemented with an appropriate dose of UV-B (Ultraviolet-B).The peachgene in the peach genome was identified by using the Plant TFDB database.Phylogenetic tree, chromosome localization, relative mass and isoelectric point and other physical and chemical properties ofmember were analyzed with Clustal W, MEGA6.0, ProtParam tool, MCScanX, Circos, SMART, NCBI-CDD, ExPASy, GSDS2.0, and MEME, respectively. The expression pattern ofgene family in different tissues was analyzed, and the expression of some members ofgene family in peach treated with UV-B was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR).【Result】48 members oftranscription factor family were identified from the whole genome of the peach, and they could be divided into 9 categories by constructing a phylogenetic tree. Thegene showed uneven distribution on 8 chromosomes of peach. The theoretical isoelectric point of the family protein was ranged from 4.36 to 7.56, and the average number of amino acids encoded was 590.52. Gene’s structure analysis showed that 40 genes contained no introns, and 8 genes contained 1 intron. Conservative elemental analysis revealed that thefamily contains 20 conserved elements, of which Motif 2 and Motif 4 were highly conserved in thefamily. Members of the same subfamily contained the same conserved elements, suggesting that members of the same subfamily might have similar functions. However, some subfamily members had different expression patterns, which might be related to sequences other than the conserved motif. Thegenes had different expression patterns in different tissues; and most ofgenes could respond to UV-B treatment, but the expression changes were different in different tissues. In leaves,was up-regulated after UV-B treatment, while up to 15 genes were down-regulated. In the fruit,was up-regulated by UV-B treatment, but 9 genes were down-regulated. In the phloem, 14 genes were up-regulated after UV-B treatment, whilewas most down-regulated in the phloem after treatment. 【Conclusion】A total of 48gene family members were identified from the peach genome and distributed on 8 chromosomes; mostgenes responded to UV-B treatment, but the expression changes were different in different tissues. This study laid the foundation for further analysis of thefamily of genes in response to UV-B light signals and other potential functions.

peach;gene family; bioinformatic analysis; UV-B

2019-06-11；

2019-08-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（31601706）、山東省自然科學(xué)基金（ZR2016CM09）

李晨，Tel：15650453756；E-mail：15650453756@163.com。通信222作者李冬梅，Tel：0538-8246263；E-mail：dmli2002@sdau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）