郭廣君， 韓 強(qiáng)， 劉吉山1，*， 呂素芳， 姚春陽(yáng)1，， 沈志強(qiáng)

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東省獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州256600；2.山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開(kāi)發(fā)推廣中心，山東 濱州256600；3.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600)

牛偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起牛的以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要特征的急性傳染病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、生長(zhǎng)不良[1]。PRV宿主范圍很廣，可感染豬、牛、羊等多種家畜和野生動(dòng)物，是一種極為重要的急性傳染病病原[2]。在我國(guó)，1947年在貓發(fā)現(xiàn)首例偽狂犬病。近年，陸續(xù)有豬、牛、羊、貂、狐、鹿、驢、騾等感染該病原的報(bào)道[3]。偽狂犬病毒是皰疹病毒科中抵抗力較強(qiáng)的一種，在37 ℃下的半衰期為7 h，8 ℃可存活46 d，而在25 ℃干草、樹(shù)枝、食物上可存活10～30 d，但短期保存病毒時(shí)，4 ℃較-15 ℃和-20 ℃凍結(jié)保存更好。病毒在pH 4.0～9.0之間保持穩(wěn)定。5.0%石炭酸經(jīng)2.0 min滅活，但0.5%石炭酸處理32 d后仍具有感染性。0.5%～1.0%氫氧化鈉迅速使其滅活。對(duì)乙醚、氯仿等脂溶劑以及福爾馬林和紫外線照射敏感。

2017年4—9月份，山東東營(yíng)地區(qū)幾家牛場(chǎng)的牛陸續(xù)發(fā)生發(fā)熱、流涎、眼瞼腫大、流淚、用力呼吸、腦水腫等癥狀，個(gè)別牛表現(xiàn)出瘙癢癥狀。犢牛臨床表現(xiàn)為煩躁不安，鳴叫，流涎，眼瞼腫大，流淚等；青年牛和母牛表現(xiàn)溫和，出現(xiàn)厭食，喜臥，眼瞼腫大，流淚等癥狀；犢牛發(fā)病后24～72 h內(nèi)死亡，青年牛和母牛病程在10 d以上，經(jīng)干預(yù)治療，恢復(fù)正常。其中1戶發(fā)病牛13頭，死亡3頭。病牛和死牛出現(xiàn)類(lèi)似臨床癥狀，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷，確診是由PRV感染所致。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 樣品 無(wú)菌采集鼻腔液試子及腦組織。

1.1.2 試劑 組織病毒基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipsome regent 2000購(gòu)自Invitrogen公司。PMD18-T，Primix TaqTM(LA TaqTMVersion2.0)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，其他化學(xué)試劑均為化學(xué)分析純。

1.1.3 細(xì)胞 乳倉(cāng)鼠腎(BHK-21)細(xì)胞系、豬偽狂犬病病毒SA株均由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.4 引物 根據(jù)已發(fā)表的PRVgB基因序列，設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程公司合成。gBF：5′-CGCGGATCCATGGCGGCCGTGACGCGGGCCGCCTCGGCCT-3′；gBR：5′-ACGCGTCGACCTAGCTCCACCTGCTGGAAGCGCCCGGG-3′。

1.2 方 法

1.2.1 病料采集 采集病牛鼻腔液試子及腦組織，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒基因組的提取 取病牛的腦組織用無(wú)菌生理鹽水充分研磨，并反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心5 min收集上清液，按照組織病毒基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取病毒DNA。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 BHK-21細(xì)胞的培養(yǎng) 采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)：取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2.0 mL含1.0×105個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)液，37 ℃ CO2培養(yǎng)12.0 h。

1.2.4 病毒基因組感作BHK-21細(xì)胞 在EP管中制備以下溶液：A液，用不含血清培養(yǎng)基稀釋2.0 μg病毒基因組DNA，體積為100.0 μL；B液，用不含血清培養(yǎng)基稀釋10.0 μL脂質(zhì)體(Lipfectim regent 2000)，終量100.0 μL，輕輕混合A、B液，室溫中放置20 min，期間混勻2次。

用2.0 mL不含血清培養(yǎng)液漂洗六孔板細(xì)胞2次，再加入1.0 mL不含血清培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37 ℃溫箱感作2 h，吸除無(wú)血清轉(zhuǎn)染液，加入2.0 mL 6.0%血清細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液12 h，第2天更換培養(yǎng)液,2.0%血清細(xì)胞維持培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),觀察病變情況。接種PRV作為對(duì)照，正常細(xì)胞做陰性對(duì)照。

1.2.5 病毒半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)測(cè)定 將病毒培養(yǎng)液作連續(xù)10倍稀釋?zhuān)?0-1，10-2，…，10-10。每個(gè)稀釋度取100.0 μL加入鋪有BHK-21細(xì)胞96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)重復(fù)，并設(shè)空白細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)照,置37 ℃的5.0% CO2培養(yǎng)箱中,逐日觀察細(xì)胞病變，并記錄細(xì)胞病變孔數(shù)(CPE)，用Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。

距離比例=(高于50.0%病變率百分?jǐn)?shù)-50.0%)/(高于50.0%病變率百分?jǐn)?shù)-低于50.0%病變率的百分?jǐn)?shù))

lg(TCID50)=X=距離比例×稀釋度對(duì)數(shù)之間差+ 高于50.0%病變率稀釋度的對(duì)數(shù)

TCID50=10X/0.1 mL

1.2.6 PCR鑒定 PCR反應(yīng)體系(10.0 μL體系)：DNA模板1.0 μL，gBF 0.5 μL，gBR 0.5 μL，Primix TaqTM(LA TaqTMVersion2.0) 5.0 μL，ddH2O 3.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：96 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃ 10 s，68 ℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物電泳、克隆和序列測(cè)定。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用Omega公司膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。目的片段克隆到pMD18-T，經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

取牛鼻腔液試子及腦組織，以組織病毒基因組DNA提取試劑盒提取DNA，顯示大小在15 000 bp左右，結(jié)果如圖1。

注：泳道M為DL 15 000 Marker；數(shù)字1為陰性對(duì)照；數(shù)字2為鼻腔試子提取病毒基因組DNA；數(shù)字3為腦組織提取病毒基因組DNA。

圖1DNA提取結(jié)果

2.2 細(xì)胞病變結(jié)果

轉(zhuǎn)染48 h后，引起細(xì)胞明顯病變，與正常細(xì)胞相比可見(jiàn)病變細(xì)胞腫脹，變圓，出現(xiàn)顆粒，失去光澤，萎縮，脫落，拉網(wǎng)等現(xiàn)象(圖2a)。與接種PRV細(xì)胞病變結(jié)果相符(圖2b)，正常細(xì)胞無(wú)病變(圖2c)。

(a)病料DNA病毒基因組引起的 BHK-21細(xì)胞病變(200×) (b)PRV SA strain引起的 BHK-21細(xì)胞病變(200×) (c)BHK-21正常細(xì)胞對(duì)照(200×)

圖2細(xì)胞病變結(jié)果

2.3 TCID50計(jì)算

用Reed-Muench方法計(jì)算TCID50，結(jié)果如表1所示。經(jīng)計(jì)算，TCID50=10-4.8/0.1 mL，即將該病毒稀釋104.8接種100.0 μL可使50.0%的細(xì)胞病變。

表1 TCID50結(jié)果

2.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

用gBF/gBR引物以鼻腔液和腦組織提取DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示在1 300 bp左右有目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，結(jié)果如圖3。

注：泳道M為DL2000Marker；數(shù)字1為陰性對(duì)照；數(shù)字2為陽(yáng)性對(duì)照；數(shù)字3為鼻腔液提取DNA PCR；數(shù)字4為腦組織提取DNA PCR。

圖3PCR結(jié)果

2.5 測(cè)序結(jié)果及分析

測(cè)序得到病毒gB基因部分序列，NCBI登錄號(hào)：KX147097，827 bp，編碼260個(gè)氨基酸。進(jìn)化樹(shù)分析表明，該毒株與中國(guó)分離株SC株在同一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支中(圖4)，與其他毒株氨基酸序列同源性在94.0%～100.0%，且與國(guó)內(nèi)株的同源性高于國(guó)外株的同源性。該氨基酸序列與SC株有1個(gè)氨基酸的差異，在此片段第193位，由SC株色氨酸突變?yōu)榫彼帷?/p>

圖4 gB基因進(jìn)化樹(shù)

3 討 論

牛偽狂犬病是由皰疹病毒Ⅰ型引起的以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎等為主要癥狀的牛急性致死性傳染病[4]。近年來(lái)，牛偽狂犬病屢有發(fā)生。如湯明等[5]2002年在實(shí)驗(yàn)室診斷役牛猝死為偽狂犬病毒所致，曾憲勇等[6]2005年鑒定到3頭發(fā)病牛，袁鳳燕等[7]2009年發(fā)現(xiàn)20頭發(fā)病小黃牛。牛偽狂犬病雖然呈散發(fā)流行，但是由于目前沒(méi)有特效治療方法，病死率幾乎為100%，給養(yǎng)牛業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，所以加強(qiáng)對(duì)牛偽狂犬病的防制尤為重要[8-10]。

本試驗(yàn)取病牛鼻腔試子，提取病毒基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)，得到了特異性核酸片段，經(jīng)基因測(cè)序和實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)診斷，鑒定為偽狂犬病病毒。本次肉牛發(fā)生偽狂犬疾病，經(jīng)調(diào)查，該牛場(chǎng)上風(fēng)口為豬場(chǎng)，曾爆發(fā)偽狂犬病，通過(guò)飼養(yǎng)員交叉污染帶入牛養(yǎng)殖場(chǎng)。由于該病發(fā)現(xiàn)及時(shí)，對(duì)未發(fā)病牛群及時(shí)隔離飼養(yǎng)，并對(duì)整個(gè)牛群采取消毒、治療等措施，將損失減少到最低，通過(guò)近1年來(lái)跟蹤調(diào)查，發(fā)病牛場(chǎng)及周邊平穩(wěn)，未發(fā)生相關(guān)疫情。偽狂犬病病毒可以通過(guò)空氣傳播，如豬發(fā)病或豬帶毒，牛吸入含病毒粒子的空氣就會(huì)感染偽狂犬病病毒而發(fā)病。建議如發(fā)現(xiàn)牛感染偽狂犬病，要對(duì)患病牛進(jìn)行隔離防治處理，并對(duì)同群牛進(jìn)行緊急預(yù)防接種疫苗，對(duì)場(chǎng)地及養(yǎng)殖設(shè)施進(jìn)行消毒，對(duì)同群牛隔離觀察，把損失降至最小和盡早控制撲滅疫情。