李軍萍，徐崢嶸

（云南省玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南玉溪 653106）

藍(lán)莓（Vaccinium corybosum）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）植物，其果實(shí)為藍(lán)色或紅色，酸甜適中，營養(yǎng)豐富，特別是抗氧化能力為所有果品蔬菜之首，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健作用，堪稱“世界水果之王”，被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一[1]?，F(xiàn)今，主要的商業(yè)栽培品系有高叢藍(lán)莓、矮叢藍(lán)莓、兔眼藍(lán)莓等，其中高叢藍(lán)莓是分布最廣泛的一個(gè)品系，奧尼爾是南高叢藍(lán)莓的代表品種之一，適合栽培在暖溫帶至亞熱帶地區(qū)，極早熟至早熟，極豐產(chǎn)，果個(gè)大，暗藍(lán)色，果粉較多，果肉質(zhì)硬，香味濃，風(fēng)味佳，果蒂痕小、耐貯運(yùn)，對(duì)土壤的適應(yīng)性較強(qiáng)，適宜在我國長江流域大部分地區(qū)種植[2]。 作為本世紀(jì)極具發(fā)展?jié)摿Φ囊粋€(gè)新興樹種，大規(guī)模發(fā)展藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)勢在必行。但由于其材料來源有限，繁殖系數(shù)低，無法實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，而組織培養(yǎng)是解決這一問題的重要途徑。目前研究者獲得眾多不同藍(lán)莓品種的快繁體系，但奧尼爾藍(lán)莓品種組培初代培養(yǎng)的研究卻鮮有報(bào)道。本文以奧尼爾藍(lán)莓為材料，研究滅菌劑，基本培養(yǎng)基，激素濃度和種類，活性炭濃度對(duì)藍(lán)莓初代培養(yǎng)的影響，以期獲得同一藍(lán)莓品種在組織培養(yǎng)技術(shù)中共性的歸納和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為一年生藍(lán)莓品種“奧尼爾”，選用健壯無病害的帶單腋芽的莖段。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同滅菌劑對(duì)外植體生長的影響

取藍(lán)莓“奧尼爾”品種半木質(zhì)化枝條，去掉上部老葉片后，將其剪成 1.5 ～2 cm 莖段（帶 1個(gè)葉芽）為外植體，先用洗衣粉浸泡 8 min，然后用自來水沖洗 30 min 后，進(jìn)行3 次重復(fù)消毒，消毒設(shè)置 6 個(gè)處理：① 75%酒精浸泡 30 s + 0.1%升汞浸泡 5min+無菌水沖洗 5 次；② 75%酒精浸泡30 s+ 0.1%升汞浸泡 10 min+無菌水沖洗 5 次；③75%酒精浸泡 30 s+ 0.1%升汞浸泡 15 min+無菌水沖洗 5 次；④ 1%次氯酸鈉浸泡10 min+0.1%升汞浸泡 5 min+無菌水沖洗 5 次；⑤ 1%次氯酸鈉浸泡10 min+0.1%升汞浸泡 10 min+無菌水沖洗 5次；⑥ 1%次氯酸鈉浸泡10 min+0.1%升汞浸泡 15 min+無菌水沖洗 5 次。每個(gè)處理接種 20 個(gè)外植體，外植體消毒后接入改良WPM +ZT 1.5 mg/L 啟動(dòng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)各處理的污染率及外植體長勢。

1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇

以“奧尼爾”帶腋芽莖段為外植體， 設(shè)置 4 個(gè)處理：分別以MS、White、B5、改良 WPM（以水合硝酸鈣 684.00 mg/L、硝酸鉀 190.00 mg/L 和鹽酸硫胺素 0.10 mg/L 代替原 WPM 培養(yǎng)基中的硫酸鉀、氯化鈣、硫酸亞鐵）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中附加激素 ZT1.5 mg/L，1 個(gè)月后觀察其對(duì)愈傷組織和不定芽增殖生長的影響，每個(gè)處理接種 20 個(gè)外植體，3 次重復(fù)；培養(yǎng)60 d 后統(tǒng)計(jì)各處理腋芽誘導(dǎo)率與腋芽增殖倍數(shù)。

1.2.3 不同激素對(duì)叢生芽誘導(dǎo)效果

將消毒后的外植體分別接種到含不同激素種類、濃度的改良 WPM 誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。共設(shè)置8 個(gè)處理：6-BA 質(zhì)量濃度 0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L，ZT 質(zhì)量濃度 0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L 。每個(gè)處理設(shè)置 3 次重復(fù)，每個(gè)處理接種20 個(gè)外植體，60 d 后統(tǒng)計(jì)不同處理增殖倍數(shù)。

1.2.4 活性炭濃度對(duì)外植體褐化的影響

活性炭濃度設(shè)置 5 個(gè)處理：① 改良WPM+ZT 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L； ② 改 良WPM+ZT 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+100 mg/L 活 性 炭；③ 改 良WPM+ZT 1.5 mg/L+NAA0.2 mg/L+200 mg/L 活性炭；④ 改良 WPM+ZT 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+400 mg/L 活性炭；⑤ 改良WPM+ZT 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+800 mg/L 活性炭；每處理接種 20 個(gè)外植體，3次重復(fù)；分別在 7 d、14 d、21 d、28 d 統(tǒng)計(jì)藍(lán)莓外植體褐化率。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

污染率=污染外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%；

褐化率=褐化外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%；

腋芽誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出腋芽外植體個(gè)數(shù)/成活下來外植體個(gè)數(shù)×100%；

腋芽增殖倍數(shù)=誘導(dǎo)出叢芽個(gè)數(shù)/誘導(dǎo)出腋芽的外植體個(gè)數(shù)；

采用Microsoft Excel 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌劑對(duì)外植體生長的影響

由表1 知，不同滅菌劑對(duì)藍(lán)莓外植體消毒及生長影響很大，其中處理⑤對(duì)于降低外植體污染率及長勢效果較好。處理①、④滅菌不充分，污染率均超過 50%，其中處理①的污染率達(dá)到 80%，雖然側(cè)芽生長好，但有愈傷組織出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；處理③、⑥滅菌過度，雖然污染率降低到3%以內(nèi)，但側(cè)芽長勢均較差，褐化嚴(yán)重；處理②和⑤污染率分別為14%和10%，側(cè)芽生長旺盛，輕微褐化。

表2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)藍(lán)莓莖段培養(yǎng)比較

2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇

由表2 知，不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)藍(lán)莓“奧尼爾”腋芽誘導(dǎo)和增殖的影響較大，其中改良WPM 培養(yǎng)基對(duì)腋芽誘導(dǎo)效果最好，腋芽誘導(dǎo)率為70%，平均叢生芽為7.1 個(gè)；White 培養(yǎng)基誘導(dǎo)莖段腋芽的效果最差，平均叢生芽數(shù)為0.5，腋芽誘導(dǎo)率僅為5.30%，可以認(rèn)為White 培養(yǎng)基不適合 “奧尼爾”的初代培養(yǎng)。

2.3 不同激素處理藍(lán)莓腋芽的誘導(dǎo)效果

由表3 知，不同激素對(duì)藍(lán)莓“奧尼爾”腋芽誘導(dǎo)和增殖的影響較大，其中ZT 對(duì)于腋芽的誘導(dǎo)倍數(shù)明顯高于6-BA，當(dāng) ZT 濃度從 0.5 mg/L 增大至3.0 mg/L 時(shí)，腋芽平均增殖倍數(shù)呈先升高后降低趨勢，其中ZT 濃度為2.0 mg/L 時(shí)對(duì)腋芽誘導(dǎo)的倍數(shù)最高，達(dá)到6.5 倍。6-BA 在0.5 mg/L 至3.0 mg/L范圍內(nèi)對(duì)于腋芽誘導(dǎo)也有一定作用，但效果明顯低于ZT，增殖倍數(shù)僅為1.1 ～2.3 倍。

2.4 不同活性炭濃度對(duì)外植體褐化的影響

從下圖可知，活性炭對(duì)于降低藍(lán)莓外植體褐化率效果明顯。未添加活性炭的處理中，從第7 ～28 d，褐化率在所有處理中均為最高，在28 d 時(shí)達(dá)到21.6%。隨著活性炭濃度從100 mg/L 增至800 mg/L，藍(lán)莓外植體褐化率呈先降低后升高的趨勢。其中添加 200 mg/L 活性炭時(shí)褐化率達(dá)到最低，到28 d 時(shí)僅為4.8%。表明適宜的活性炭濃度能有效降低外植體褐化率。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

活性炭對(duì)外植體褐化的影響圖

外植體消毒是組織培養(yǎng)開始無菌體系構(gòu)建的第一步。各種植物及不同器官對(duì)消毒時(shí)間、方式都不一樣。消毒過程中合適的消毒劑既要能殺死植物材料表面微生物，同時(shí)又要盡可能減輕對(duì)母本植物材料造成傷害。本研究中，1%次氯酸鈉10 min+0.1%升汞10 min 既降低外植體的污染率，同時(shí)側(cè)芽長勢良好；而75%酒精30 s+ 0.1%升汞15 min 雖然污染率大大降低，但側(cè)芽長勢差，褐化嚴(yán)重。李麗容、李杰等[3-4]研究結(jié)果表明，藍(lán)莓外植體莖段用0.1% HgCl2消毒時(shí)間為6 ～9 min 時(shí)最好，成活率最高；陶興魁等[5]研究表明：一般而言，菌類污染污染率應(yīng)控制在 8%以內(nèi)；金如意[6]研究結(jié)果表明用5% NaClO 溶液消毒10 min、用0.1% HgCl2溶液消毒7 min 時(shí)外植體的消毒效果最好。本研究中，藍(lán)莓品種“奧尼爾”的消毒方法與其基本一致。

基本培養(yǎng)基主要提供植物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，但不同的植物，因其遺傳、生物學(xué)特性不同，對(duì)營養(yǎng)成分的需求也不一樣。合適的培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，而選擇正確的基本培養(yǎng)基則是組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)。據(jù)報(bào)道藍(lán)莓組織培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基較多，常用的是 MS、1/2MS、White、WPM、改良WPM、knops 培養(yǎng)基和B5 等幾種。不同基本培養(yǎng)基對(duì)藍(lán)莓不同品種腋芽的誘導(dǎo)效果也不同。陶俊鋒[7]等研究表明，兔眼藍(lán)莓品種“燦爛”腋芽誘導(dǎo)與增殖的最適合培養(yǎng)基為1/2MS；廉家盛[8]等認(rèn)為，B5 培養(yǎng)基最適合“美登”藍(lán)莓不定芽增殖生長；馬艷麗[9]等研究得出，對(duì)于高叢藍(lán)莓用改良MS 培養(yǎng)，最高再生率可達(dá)75% ；而對(duì)兔眼藍(lán)莓用改良knops 培養(yǎng)最合適；饒寶蓉、陸衛(wèi)明、沙玉芬、王明瑩[10-13]等認(rèn)為WPM 培養(yǎng)適用于藍(lán)莓品種“夏普藍(lán)”、北高叢藍(lán)莓品種“杜克”、矮叢藍(lán)莓品種“美登”等莖段誘導(dǎo)。本研究結(jié)果表明，改良WPM 基本培養(yǎng)基有利于南高叢品種“奧尼爾”莖段腋芽的誘導(dǎo)和增殖，可能是由于改良WPM 含有較高的無機(jī)鹽濃度和較多的Ca 元素，適應(yīng)藍(lán)莓的生長。

表3 不同激素及濃度對(duì)藍(lán)莓腋芽誘導(dǎo)比較

植物組織培養(yǎng)中， 細(xì)胞分裂素對(duì)芽的誘導(dǎo)和增殖起到至關(guān)重要的作用 。廉家盛[8]、李森、史文君、蘇艷、張力思[14-17]等研究表明ZT 對(duì)藍(lán)莓叢生芽的誘導(dǎo)和增殖具有顯著效果，且不同的藍(lán)莓品種其用量也有差別。本研究表明：當(dāng) ZT 濃度從 0.5 mg/L 增大至3.0 mg/L 時(shí)，腋芽平均增殖倍數(shù)呈先升高后降低趨勢， 這個(gè)規(guī)律與徐宏[18]等研究一致；而最適合“奧尼爾”的誘導(dǎo) ZT 濃度為2.0 mg/L。本試驗(yàn)中，6-BA 對(duì)促進(jìn)藍(lán)莓生長、增殖的效果不十分明顯，這與李森[14]、董朝莉[19]、趙燕麗[20]等的研究結(jié)論一致。

3.2 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：藍(lán)莓“奧尼爾”初代培養(yǎng)中，莖段的最佳消毒方式為1%次氯酸鈉10 min+0.1%升汞10 min，改良WPM 培養(yǎng)基對(duì)腋芽誘導(dǎo)效果最好，ZT 濃度為2.0 mg/L 時(shí)對(duì)腋芽誘導(dǎo)的倍數(shù)最高，添加 200 mg/L 活性炭時(shí)褐化率達(dá)到最低。在植物組培初代培養(yǎng)過程中，影響制約外植體成苗的因素很多，本試驗(yàn)僅對(duì)藍(lán)莓“奧尼爾”滅菌劑、基本培養(yǎng)基、激素濃度和種類、活性炭濃度進(jìn)行了初探，外植體的部位、取材時(shí)間，不同激素的配比、光照條件等因素仍需要進(jìn)一步研究。