覃菲菲

（廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西南寧 530021）

誘變育種廣泛用于谷氨酸生產(chǎn)菌育種，是首選的育種方法，本文主要論述谷氨酸產(chǎn)生菌誘變技術(shù)的最新研究進(jìn)展，根據(jù)對(duì)谷氨酸產(chǎn)生菌誘變的因子不同，可分為以下四大類：物理誘變技術(shù)；化學(xué)誘變技術(shù)；復(fù)合誘變技術(shù)；常壓室溫等離子體誘變技術(shù)。從各個(gè)方面綜合論述了誘變技術(shù)的原理、應(yīng)用以及特點(diǎn)。探索新方法和新技術(shù)，為日后提高工業(yè)發(fā)酵谷氨酸的產(chǎn)量和開發(fā)優(yōu)質(zhì)谷氨酸產(chǎn)生菌株提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。

1 物理誘變

物理誘變技術(shù)是利用各種射線的輻射作用，如紫外線，X射線，γ 射線等，造成菌體的DNA 的結(jié)構(gòu)變化，從中篩選正向突變的突變體，最終獲得目的菌株。常用的物理誘變技術(shù)有紫外線誘變與X 射線誘變兩類。

紫外誘變是物理誘變技術(shù)的代表，也是一種有效的誘變手段。通過(guò)紫外誘變對(duì)出發(fā)菌體進(jìn)行處理后，能獲得預(yù)期的結(jié)果，如副產(chǎn)物高產(chǎn)或改變菌體性狀。

設(shè)定一定劑量的紫外線對(duì)菌體輻射一段時(shí)間，紫外線即能引起DNA 變化，使菌株突變。紫外線引起的DNA 構(gòu)象變化很多，包括DNA 片段化，雙鏈DNA 分子交叉連接，胸腺嘧啶二聚體的形成等。杜軍等以GDK6菌作為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外線定向誘變L-谷氨酸生產(chǎn)菌，結(jié)果GDK9菌株產(chǎn)酸能力提高且高產(chǎn)性狀遺傳穩(wěn)定，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到 62.2%。吳學(xué)超等把B6-1株經(jīng)過(guò)三輪紫外誘變，最終得到聚谷氨酸高產(chǎn)的突變株W003，聚谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)率從起始菌10.9g/L 提高到20.5g/L。

X 射線是波長(zhǎng)介于紫外線和γ 射線 間的電磁輻射。同步輻射源可產(chǎn)生高強(qiáng)度的連續(xù)譜X 射線，使用其產(chǎn)生的X 射線直接對(duì)菌體輻照一段時(shí)間，使染色體斷裂，最終造成遺傳物質(zhì)變異。

同步輻射軟X 射線已被應(yīng)用于微生物誘變。軟X 射線能量轉(zhuǎn)移密度比硬X 射線大，所以相對(duì)生物效應(yīng)高。低能量的軟X 射線對(duì)菌體的DNA 中某些重要的微量元素具有特殊的吸收作用，從而導(dǎo)致在菌體細(xì)胞中產(chǎn)生更多的染色體畸變。劉苗等以SW07-1為原始菌株，經(jīng)過(guò)軟X 射線誘變，使菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中逐步適應(yīng)較高的溫度，最終獲得耐高溫的谷氨酸突變菌株，達(dá)到育種目的。

2 化學(xué)誘變

化學(xué)誘變是通過(guò)分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的試劑開展的，引起遺傳物質(zhì)損傷或錯(cuò)誤修復(fù)產(chǎn)生突變體，可導(dǎo)致基因突變，或選擇性作用于一個(gè)特定的基因、核酸。依據(jù)誘變劑與DNA 作用方式的不同可分為烷化劑誘變、移碼突變劑誘變兩大類。

烷化劑是化學(xué)誘變技術(shù)中最常用的試劑，包括硫酸二乙酯、亞硝基胍、亞硝基乙基脲、甲基磺酸甲酯等。為了提高菌株的正突變率，通常采用兩種或兩種以上烷化劑同時(shí)或交替使用，價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單、不需要復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備、效果明顯。

烷化劑在菌體內(nèi)能形成C2+或活潑親電性基團(tuán)，實(shí)驗(yàn)設(shè)定一定濃度的烷化劑加入菌體培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)過(guò)程中，試劑可以與生物大分子中含有豐富電子的基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使其喪失活性，或使DNA 分子發(fā)生斷裂。王衛(wèi)對(duì)菌株HG-009進(jìn)行了化學(xué)誘變來(lái)提高γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量，通過(guò)2%的硫酸二乙酯（DES）誘變15min，將γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量由61.90mg/g 提升到71.39mg/g。朱麗娟以谷氨酸產(chǎn)生菌HD11為出發(fā)菌株，使用硫酸二乙酯對(duì)菌株進(jìn)行單因子誘變，篩選出聚谷氨酸高產(chǎn)菌株F12，聚谷氨酸產(chǎn)率達(dá)到20.27g/L，比出發(fā)菌株高39.2%。

移碼突變劑具有平面三環(huán)結(jié)構(gòu)，以某種濃度加入菌株培養(yǎng)基后，隨著菌體的生長(zhǎng)，試劑可插人到正常DNA 雙鏈分子臨近的堿基對(duì)之間，導(dǎo)致堿基突變，使遺傳密碼轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生錯(cuò)誤，引起菌種性狀改變。Ferguson 等認(rèn)為移碼突變更多可能發(fā)生在重復(fù)堿基區(qū)域內(nèi)。移碼突變劑主要包括吖啶黃、吖啶橙等吖啶類化合物以及原黃素、溴化乙錠等。于芳以谷氨酸產(chǎn)生菌ATCC13870為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行吖啶黃與紫外線復(fù)合誘變，定向選育然后篩選得到菌株Ⅱ-169，其酸產(chǎn)量達(dá)23.8g/L，較出發(fā)菌提高14.4%，副產(chǎn)物量降低了12.5%。

3 復(fù)合誘變

隨著研究的進(jìn)展，誘變的手段更加多樣化，研究人員已不局限于單一因素對(duì)菌株的誘變。為了提高誘變的效果，通常使用兩個(gè)或兩個(gè)以上的誘變劑同時(shí)或依次作用，甚至是物理因子和化學(xué)因子配合來(lái)復(fù)合誘變的處理方法。

主要包括三個(gè)方面：多種物理因子誘變、物理—化學(xué)因子復(fù)合誘變、化學(xué)—物理—化學(xué)因子交叉復(fù)合誘變。李雪等利用CGMCC3336為出發(fā)菌株，通高鹽-高溫復(fù)合手段得到高轉(zhuǎn)化率菌株TKBCPG-009，新菌株能將發(fā)酵底物谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化率提高16%。喬長(zhǎng)晟等以BCPG006 為起始菌株，通過(guò)紫外線和He-Ne 激光復(fù)合誘變處理，選育出的突變株BCPG078，發(fā)酵后所得聚谷氨酸的量為16g/L，為起始菌的2.67倍。張瑞等以γ-多聚谷氨酸解淀粉芽胞桿菌C1為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行紫外線-亞硝基胍復(fù)合誘變，通過(guò)復(fù)合誘變選育得到正突變菌株C1-6，其γ-PGA 的產(chǎn)量由18.4g/L 提高到24.2g/L，增加了31.5%。

物理誘變與化學(xué)誘變技術(shù)發(fā)展時(shí)間較長(zhǎng)，各方面研究較成熟，所以谷氨酸菌誘變技術(shù)大部分首選二者進(jìn)行復(fù)合誘變。根據(jù)當(dāng)下的研究結(jié)果，綜合各種因子的復(fù)合誘變比單一因子誘變效果好。

4 常壓室溫等離子體誘變

隨著科技的發(fā)展，各學(xué)科間的交叉應(yīng)用受到國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的重視，研究出更先進(jìn)、更復(fù)雜的技術(shù)，來(lái)適應(yīng)更高的研究標(biāo)準(zhǔn)。目前研究中出現(xiàn)的新型誘變方法主要有：常壓室溫等離子體、高能電子流、超高壓、離子注入等。

其中常壓室溫等離子體（ARTP）在生物誘變育種領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[7]。ARTP 誘變技術(shù)有能夠有效造成DNA 多樣性的損傷，突變率高，并易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株，操作簡(jiǎn)便成本低，無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)

常壓室溫等離子體（ARTP）能夠在大氣壓下產(chǎn)生溫度在25～40 ℃的具有高活性粒子濃度的等離子體射流。等離子體中的活性粒子作用于菌種，能夠使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并誘發(fā)細(xì)胞啟動(dòng)SOS 修復(fù)機(jī)制，修復(fù)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生種類豐富的錯(cuò)配位點(diǎn)，進(jìn)而使DNA 序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)顯著變化，最終導(dǎo)致菌種突變。

陳雙喜等對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌HD11進(jìn)行等離子體誘變處理，獲得高產(chǎn)菌株HNCL1266，其γ-聚谷氨酸搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為26g/L，較出發(fā)菌提高了30%。梁玲等以谷氨酸棒桿菌GY1為研究對(duì)象，采用ARTP 進(jìn)行全局誘變，經(jīng)過(guò)初篩與搖瓶復(fù)篩，獲得突變株YAG117，其發(fā)酵L-谷氨酸含量達(dá)16.3g/L，較出發(fā)菌株提高13.9%?？讕浀纫怨劝彼岚魲U菌23798為原始菌株，對(duì)其進(jìn)行ARTP 誘變，發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩48h，選育出一株高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變谷氨酸棒桿菌B1，L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)18.5g/L，比原始菌株提高62.03%。杜丹清等以γ-聚谷氨酸地衣芽孢桿菌QY-27為出發(fā)菌株，通過(guò)常壓室溫等離子體（ARTP）誘變，篩選獲得一株高產(chǎn)菌株QS-21，γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量較出發(fā)菌株的9.12g/L 提高了42.26%。

ARTP 誘變技術(shù)是綜合了物理和化學(xué)誘變特性為一體的新方法，在擴(kuò)大菌種源，優(yōu)良品種的篩選，及提高誘變效率等方面，將發(fā)揮重要的作用。隨著各學(xué)科間的合作日益普遍，高新技術(shù)已進(jìn)入學(xué)科交叉研究時(shí)代，ARTP 誘變技術(shù)就是其中典型的例子，不久之后會(huì)得到更廣泛的應(yīng)用。

5 結(jié)語(yǔ)

目前谷氨酸菌株育種還是采用誘變技術(shù)。因其具有簡(jiǎn)便、易行、安全以及菌種遺傳穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，每一種誘變技術(shù)的基本原理、作用機(jī)制均不相同，其中涉及到物理、化學(xué)、生物等多種學(xué)科，研究空間大，有利于應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。誘變技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)相對(duì)成熟，但仍有突破點(diǎn)：復(fù)合誘變的可能性很大，可嘗試不同的組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；當(dāng)誘變效率低時(shí)，應(yīng)考慮到誘變因子的參數(shù)設(shè)定；新技術(shù)如常壓室溫等離子體誘變等具體是何種效應(yīng)引起的基因突變還未有明確定論，應(yīng)加大基礎(chǔ)理論的研究；誘變技術(shù)存在局限性時(shí)，可考慮與其他技術(shù)結(jié)合使用；把原生質(zhì)體融合以及生物工程技術(shù)應(yīng)用到誘變中。隨著學(xué)科間的交叉領(lǐng)域研究的深入，誘變技術(shù)技術(shù)在未來(lái)會(huì)有很大進(jìn)展，可以選育出更高產(chǎn)和更高性能的谷氨酸產(chǎn)生菌株。