喬巨慧 趙大慶 劉美辰 睢博文 劉穎 邢欣

摘 要 目的：研究人參總皂苷對(duì)D-半乳糖致PC12細(xì)胞衰老的改善作用及其機(jī)制。方法：將大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12）細(xì)胞用D-半乳糖處理以建立細(xì)胞衰老模型。采用CCK-8法篩選D-半乳糖的建模濃度和人參總皂苷的給藥濃度。試驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組、模型組和人參總皂苷低、高濃度組，檢測(cè)各組細(xì)胞衰老情況、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期和細(xì)胞中線粒體膜電位（MMP）、三磷酸腺苷（ATP）、活性氧（ROS）水平以及凋亡相關(guān)蛋白[B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）及其相關(guān)蛋X蛋白（Bax）、細(xì)胞色素C（Cyt-C）]和氧化損傷相關(guān)蛋白[核因子2相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素氧合酶1（HO-1）]表達(dá)水平，另設(shè)陽(yáng)性藥物組[5 mmol/L N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）]和陽(yáng)性對(duì)照組[D-半乳糖+5 mmol/L NAC]比較氧化損傷相關(guān)蛋白水平。結(jié)果：D-半乳糖能顯著抑制PC12細(xì)胞的存活率，臨界濃度為20 mg/mL;人參總皂苷可顯著增加D-半乳糖誘導(dǎo)衰老細(xì)胞的存活率，半數(shù)效應(yīng)濃度為65 μg/mL，故將后續(xù)試驗(yàn)人參總皂苷的低、高濃度設(shè)置為55、65 μg/mL。與正常對(duì)照組比較，模型組衰老細(xì)胞數(shù)明顯增加，細(xì)胞凋亡率和G1期細(xì)胞比例均顯著增加，S期細(xì)胞比例、細(xì)胞中MMP、ATP含量和Bcl-2蛋白以及線粒體中Cyt-C蛋白表達(dá)水平均顯著降低，ROS含量和Bax、Nrf2蛋白及胞漿內(nèi)Cyt-C蛋白表達(dá)均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，人參總皂苷低、高濃度組衰老細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞凋亡率和G1期細(xì)胞比例均顯著降低，S期細(xì)胞比例、細(xì)胞中MMP、ATP（除低濃度組外）含量和Bcl-2、Nrf2、HO-1蛋白以及線粒體中Cyt-C蛋白表達(dá)水平均顯著升高，ROS（除低濃度組外）含量和Bax蛋白及胞漿內(nèi)Cyt-C蛋白表達(dá)水平均顯著降低;陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平亦顯著升高（P<0.05或P<0.01），但均低于人參總皂苷組。結(jié)論：人參總皂苷可改善D-半乳糖誘導(dǎo)的P12細(xì)胞衰老，其機(jī)制可能與激活Nrf2抗氧化信號(hào)途徑拮抗D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、緩解其所致的線粒體功能障礙有關(guān)。

關(guān)鍵詞 人參總皂苷;D-半乳糖;PC12細(xì)胞;衰老;線粒體;凋亡相關(guān)蛋白;氧化損傷相關(guān)蛋白

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the improvement effects of total ginsenosides on the senescence of PC12 cells induced by D-galactose and its mechanism. METHODS： Rat pheochromocytoma （PC12） cells were treated with D-galactose to establish cell senescence model. CCK-8 method was used to screen the D-galactose modeling concentration and total ginsenosides concentration. Normal control group， model group， total ginsenosides low and high concentration groups were set up. Cell senescence， cell apoptosis rate， apoptotic cycle and mitochondrial membrane potential （MMP）， cell adenosine triphosphate （ATP） and reactive oxygen species （ROS） levels in each group were detected. The expression of apoptosis related proteins [B lymphoma 2 （Bcl-2） and its related egg X protein （Bax）， cytochrome C （Cyt-C）] and oxidative damage related proteins [nuclear factor 2 related factor 2 （Nrf2），heme oxygenase 1 （HO-1）] were detected. In addition， positive drug group [5 mmol/L N-acetyl-L-cysteine （NAC）] and positive control group [D-galactose+5 mmol/L NAC] were set up to compare the levels of oxidative damage related proteins. RESULTS： D-galactose could significantly inhibit the survival rate of PC12 cells， with a critical concentration of 20 mg/mL. The total ginsenosides could significantly increase the survival rate of D-galactose induced senescent cells with a median effective concentration （EC50） of 65 μg/mL，and then the low and high concentrations of total ginsenosides were set at 55 and 65 μg/mL. Compared with normal control group， the number of aging cells increased， the apoptotic rate and percentage of G1 phase were significantly increased in model group. the percentage of S phase， MMP and ATP contents， the protein expression of Bcl-2 and Cyt-C in mitochondria were decreased significantly， while ROS content， the protein expression of Bax， Nrf2 and Cyt-C protein in endochylema were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the number of aging cells reduced， the apoptosis rates and percentage of G1 phase were significantly decreased in total ginsenosides low and high concentration groups， the percentage of S phase， the contents of MMP and ATP （except for low concentration group）， protein expression of Bcl-2， Nrf2 and HO-1 as well as protein expression of Cyt-C in mitochondria were increased significantly; ROS level （except for low concentration group） and Bax protein as well as protein expression of Cyt-C were decreased significantly. The protein expression of Nrf2 and HO-1 were increased significantly in positive control group （P<0.05 or P<0.01）， but it was lower than that of total ginsenosides groups. CONCLUSIONS： Total ginsenosides can improve D-galactose induced senescence of P12 cells，the mechanism of which may be related to activating Nrf2 antioxidant signal pathway to antagonize D-galactose induced oxidative stress and alleviating mitochondrial dysfunction.

KEYWORDS ? Total ginsenosides; D-galactose; PC12 cells; Senescence; Mitochondria; Apoptosis related protein; Oxidative damage related protein

衰老是神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的主要誘因，包括阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森?。≒D）在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病均表現(xiàn)出了典型的年齡依賴性[1]。這提示加速衰老的因子可能參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，而延緩衰老可能會(huì)減少該類疾病的發(fā)生。衰老機(jī)制復(fù)雜，涉及基因組穩(wěn)定性下降、表觀遺傳改變、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、蛋白水解異常、端?？s小、干細(xì)胞耗竭、線粒體功能障礙等多種因素[2-3]。其中，鑒于神經(jīng)元代謝過(guò)程的高需氧量，線粒體功能紊亂可能是神經(jīng)元衰老的核心因素[4]，同時(shí)也是引發(fā)神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵因素[5]。因此，尋找能夠有效維系線粒體功能進(jìn)而延緩衰老的藥物，對(duì)于防治神經(jīng)退行性疾病和衰老均具有十分重要的意義。

人參是被學(xué)者普遍認(rèn)可的可以延年益壽的傳統(tǒng)中藥材之一，其具有大補(bǔ)元?dú)狻⑸蛑箍?、安神益智、補(bǔ)脾益肺的功效[6-8]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》提到，人參可以“補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，久服輕身延年”[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參中的皂苷類成分可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激而延緩衰老，并對(duì)AD、PD等多種神經(jīng)退行性疾病具有治療作用[10-12]，但其作用機(jī)制尚不明確。PC12細(xì)胞是常用的神經(jīng)細(xì)胞株，是來(lái)源于成年大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞系。本研究利用D-半乳糖誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模擬衰老模型，擬探索人參總皂苷對(duì)該細(xì)胞衰老的改善作用及其可能機(jī)制，旨在為深入研究人參總皂苷防治神經(jīng)退行性疾病和衰老提供參考。

1 材料

1.1 儀器

iBright FL 1000型智能凝膠成像系統(tǒng)、FormaTM 3型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、EVOS FL Auto型全自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;Infinite? 200 Pro型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（上海帝肯貿(mào)易有限公司）;Flow Sight型多維全景流式細(xì)胞儀（德國(guó)Merck Millipore公司）;Mini Protean型蛋白電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;Seahorse XFp型能量代謝分析儀（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

人參總皂苷[上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S25997，純度：≥80%（以人參皂苷Re計(jì)）];D-半乳糖（大連美侖生物科技有限公司，批號(hào)：MB1853-1，純度：≥97%）;N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，美國(guó)Med Chem Express公司，批號(hào)：HY-B0215，純度：≥97%）;滅活胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）;胰蛋白酶和青霉素-鏈霉素雙抗（美國(guó)Molecular Research Center公司）;細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、線粒體細(xì)胞分離試劑盒、2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）熒光探針溶液、細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒、三磷酸腺苷（ATP）檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、羅丹明123染色工作液、細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為C1052、P0013K、C3601、S0033-1、C0602、S0026、P0012S、C2007、P0027、P0018AS、S0033S）;異硫氰酸熒光素（FITC）-膜聯(lián)蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）凋亡檢測(cè)細(xì)胞試劑盒（美國(guó)BD Pharmingen公司，批號(hào)：556547）;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配置液（北京索萊寶科技有限公司）;CCK-8試劑盒（美國(guó)Boster Biological Technology公司，批號(hào)：AR1199）;兔源B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）及其相關(guān)X蛋白（Bax）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（北京艾斯廷科技有限公司，批號(hào)分別為ab196495、ab53154、ab245357）;兔源細(xì)胞色素C（Cyt-C）、細(xì)胞色素C氧化酶Ⅳ（Cox Ⅳ）多克隆抗體（上海愛(ài)必信生物科技有限公司，批號(hào)分別為abs130083、abs131570）;兔源核因子2相關(guān)因子2（Nrf2）單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：12721S）;鼠源血紅素氧合酶1（HO-1）、核纖層蛋白B（Lamin B）單克隆抗體（美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)分別為66743-1-Ig、66095-1-Ig）;堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：A3687）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

大鼠PC12細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院（上海）細(xì)胞庫(kù)，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)人參科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)室留種保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞用含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%且生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，用胰蛋白酶消化，傳代，自第4代起用。

2.2 D-半乳糖對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響

采用CCK-8法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞按1.6×108個(gè)/L、200 μL/孔接種于96孔板中。試驗(yàn)設(shè)空白組、正常對(duì)照組和模型組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M不含細(xì)胞和藥物;正常對(duì)照組細(xì)胞用完全培養(yǎng)液（RPMI 1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素雙抗）培養(yǎng);模型組細(xì)胞用D-半乳糖終質(zhì)量濃度分別為5、10、20、30、40 mg/mL的完全培養(yǎng)液分別在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8工作液20 μL，振蕩混勻，繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h后，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（A）值并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（試驗(yàn)組A值-空白組A值）/（正常對(duì)照組A值-空白組A值）×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析;P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（統(tǒng)計(jì)方法下同）。結(jié)果，當(dāng)D-半乳糖質(zhì)量濃度為20 mg/mL及以上時(shí)，細(xì)胞存活率顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01），詳見(jiàn)表1。因此，選取對(duì)P12細(xì)胞起毒性作用的臨界濃度20 mg/mL作為后續(xù)試驗(yàn)中D-半乳糖的干預(yù)濃度。

2.3 人參總皂苷對(duì)PC12衰老細(xì)胞活力的影響

采用CCK-8法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞按1.6×108個(gè)/L、200 μL/孔接種于96孔板中。試驗(yàn)設(shè)空白組、正常對(duì)照組、模型組和藥物組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。空白組和正常對(duì)照組均按“2.2”項(xiàng)下方法處理培養(yǎng);模型組和藥物組細(xì)胞用含20 mg/mL D-半乳糖的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，藥物組細(xì)胞再加入人參總皂苷終質(zhì)量濃度分別為1、2、4、8、16、32、64 μg/mL（給藥濃度按預(yù)試驗(yàn)設(shè)置）的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后按“2.2”項(xiàng)下“每孔加入CCK-8工作液20 μL”起進(jìn)行操作，同法檢測(cè)各孔的A值并計(jì)算細(xì)胞存活率和半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）。試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果，與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，人參總皂苷能提高PC12衰老細(xì)胞的存活率，并隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞存活率也有增加趨勢(shì)，其中當(dāng)質(zhì)量濃度為8 μg/mL及以上時(shí)，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見(jiàn)表2。人參總皂苷對(duì)PC12衰老細(xì)胞的EC50為65 μg/mL，為便于試驗(yàn)延續(xù)，選擇55、65 μg/mL作為后續(xù)試驗(yàn)中人參總皂苷的給藥濃度。

2.4 人參總皂苷對(duì)PC12衰老細(xì)胞數(shù)的影響

采用β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞按4×108個(gè)/L、2 mL/孔接種于6孔板中。試驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組、模型組和藥物組，除藥物組中人參總皂苷終質(zhì)量濃度分別為55、65 μg/mL（分別記為人參總皂苷低、高濃度組，下同）外，其余處理、培養(yǎng)條件均與“2.3”項(xiàng)相同。培養(yǎng)24 h后，按照細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，在倒置顯微鏡下觀察并對(duì)藍(lán)色衰老陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果，與正常對(duì)照組比較，D-半乳糖處理過(guò)的P12細(xì)胞中衰老細(xì)胞數(shù)明顯增加;經(jīng)人參總皂苷處理后，各藥物組的衰老細(xì)胞數(shù)均較模型組明顯減少，詳見(jiàn)圖1。

2.5 人參總皂苷對(duì)PC12衰老細(xì)胞凋亡率的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞按4×108個(gè)/L、2 mL/孔接種于6孔板中。按“2.4”項(xiàng)下方法分組、培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，加入胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，再用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）漂洗2次，再按照FITC-Annexin Ⅴ凋亡檢測(cè)細(xì)胞試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡率：凋亡率=早期細(xì)胞凋亡率+晚期細(xì)胞凋亡率。結(jié)果，正常對(duì)照組、模型組和人參總皂苷低、高濃度組細(xì)胞的凋亡率分別為（15.85±1.54）%、（21.33±1.06）%、（12.76±1.89）%、（11.15±2.48）%（n=3）。與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞的凋亡率顯著增加（P<0.05）;與模型組比較，人參總皂苷低、高濃度組細(xì)胞凋亡率均顯著降低（P<0.01），詳見(jiàn)圖2（圖中，R2是正常細(xì)胞，R3是晚期凋亡細(xì)胞，R4是壞死細(xì)胞，R5是早期凋亡細(xì)胞）。

2.6 人參總皂苷對(duì)PC12衰老細(xì)胞周期的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。按“2.5”項(xiàng)下方法分組、培養(yǎng)、處理至“PBS漂洗2次”，隨后加入4 ℃ 75%乙醇固定過(guò)夜，再用4 ℃PBS洗滌2次，1 000 r/min離心5 min，根據(jù)細(xì)胞周期試劑盒說(shuō)明書(shū)方法配制碘化丙啶（PI）染色試劑，在37 ℃避光溫浴30 min后，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果，與正常對(duì)照組比較，模型組G1細(xì)胞比例顯著升高，S期細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01），而G2期細(xì)胞比例組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，人參總皂苷低、高濃度組G1期細(xì)胞比例顯著降低（P<0.01），人參總皂苷高濃度組S期細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05），詳見(jiàn)表3。

2.7 線粒體膜電位（MMP）檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。按“2.4”項(xiàng)下方法分組、培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，細(xì)胞用胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，收集沉淀，用PBS輕輕洗滌2次，在避光條件下，每孔加入羅丹明123染色工作液500 μL，使其終濃度為1～2 μmol/L，輕輕混勻，于37 ℃孵育30 min，棄去上清液，用PBS輕輕洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞MMP，結(jié)果以各組與正常對(duì)照組的比值表示。試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果，與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞MMP顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，人參總皂苷低、高濃度組細(xì)胞MMP均顯著升高（P<0.01），詳見(jiàn)圖3。

2.8 細(xì)胞內(nèi)ATP含量檢測(cè)

按“2.4”項(xiàng)下方法分組、培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入RIPA裂解液200 μL，4 ℃下1 000 r/min離心5 min，取上清液用于后續(xù)的檢測(cè)。根據(jù)ATP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)ATP含量，結(jié)果以各組與正常對(duì)照組的比值表示。結(jié)果，與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，人參總皂苷高濃度組細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著升高（P<0.01），詳見(jiàn)圖4。

2.9 細(xì)胞中ROS含量檢測(cè)

采用DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)。按“2.4”項(xiàng)下方法分組、培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，用PBS漂洗2次，加入預(yù)先用PBS稀釋的DCFH-DA熒光探針溶液100 μL，在37 ℃避光條件下孵育30 min，期間每5 min混勻1次，使探針和細(xì)胞充分接觸;再以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，細(xì)胞用PBS漂洗3次，以充分除去未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA，免除干擾;最后用PBS 200 μL重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀在488 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞中ROS的含量，結(jié)果以各組與正常對(duì)照組的檢驗(yàn)結(jié)果比值表示。試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果，與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中ROS含量顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，人參總皂苷高濃度組細(xì)胞中ROS含量顯著降低（P<0.01），詳見(jiàn)圖5。

2.10 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blotting法檢測(cè)。按“2.4”項(xiàng)下方法分組、培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，在冰浴條件下，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。按線粒體細(xì)胞分離試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取線粒體蛋白和胞漿蛋白。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，于沸水中加熱8 min變性。取適量變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜0.5 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，在4 ℃條件下加入Bcl-2、Bax、Cyt-C、Cox Ⅳ、GAPDH一抗（稀釋比例為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過(guò)夜;用PBST溶液洗滌3次（每次5 min），再加入二抗（稀釋比例為1 ∶ 10 000），室溫孵育1 h，用PBST溶液洗滌3次（每次5 min）。加入特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，于凝膠成像系統(tǒng)上成像，采用J 1.52a Image軟件分析，分別以Bcl-2、Bax與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值表示細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)水平，以Cyt-C與GAPDH的灰度值比值表示胞漿內(nèi)Cyt-C蛋白的表達(dá)水平，以Cyt-C與Cox Ⅳ的灰度值比值表示線粒體內(nèi)Cyt-C蛋白的表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果，與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和線粒體內(nèi)Cyt-C蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，細(xì)胞內(nèi)Bax和胞漿內(nèi)Cyt-C蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，人參總皂苷低、高濃度組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和線粒體內(nèi)Cyt-C蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，細(xì)胞內(nèi)Bax和胞漿內(nèi)Cyt-C蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見(jiàn)圖6、表4。

2.11 細(xì)胞氧化損傷相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blotting法檢測(cè)。按“2.4”項(xiàng)下方法分組、培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，按“2.10”項(xiàng)下方法提取細(xì)胞總蛋白。采用細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒按說(shuō)明書(shū)提取核蛋白，檢測(cè)氧化損傷相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1表達(dá)，一抗稀釋比例為1 ∶ 1 000，二抗稀釋比例為1 ∶ 10 000，另設(shè)陽(yáng)性藥物組和陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行比較。陽(yáng)性藥物組細(xì)胞用含5 mmol/L NAC的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞先用含5 mmol/L NAC的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h，再用含20 mg/mL D-半乳糖的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。以Nrf2與Lamin B的灰度值比值表示細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)水平，以HO-1與GAPDH的灰度值比值表示細(xì)胞內(nèi)HO-1蛋白的表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果，與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和人參總皂苷低、高濃度組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2與細(xì)胞內(nèi)HO-1蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且人參總皂苷低、高濃度組Nrf2蛋白的表達(dá)水平略高于陽(yáng)性對(duì)照組（P>0.05），HO-1蛋白的表達(dá)水平顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.01），推測(cè)人參總皂苷激活Nrf2信號(hào)通路可能是由ROS介導(dǎo)的，詳見(jiàn)圖7、表5。

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)，線粒體與細(xì)胞衰老調(diào)控的關(guān)系都是學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一，線粒體數(shù)量、結(jié)構(gòu)及其功能的變化都能影響細(xì)胞衰老的過(guò)程與進(jìn)程，已研究發(fā)現(xiàn)，可靶向作用于線粒體的天然產(chǎn)物活性分子或天然產(chǎn)物提取物在衰老調(diào)控及衰老相關(guān)疾病的預(yù)防和治療領(lǐng)域具有廣闊前景[13]。

D-半乳糖在正常情況下可經(jīng)肝臟代謝成葡萄糖，但當(dāng)其濃度較高時(shí)，D-半乳糖的積累不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓變化、細(xì)胞腫脹、膜脂損傷、腦神經(jīng)退化，還可觸發(fā)ROS的生成，ROS自由基再與氨基酸和蛋白質(zhì)反應(yīng)形成高級(jí)糖基化終產(chǎn)物，而這一產(chǎn)物在許多年齡相關(guān)的退行性疾病中很常見(jiàn)[14-16]。筆者采用D-半乳糖處理PC12細(xì)胞，證實(shí)了D-半乳糖確實(shí)可以促進(jìn)ROS生成，加速衰老進(jìn)程，主要表現(xiàn)在細(xì)胞存活率降低、衰老細(xì)胞數(shù)增加，并且將細(xì)胞阻滯在G1期。

本研究主要以人參總皂苷的抗氧化以及線粒體功能維系作用為基礎(chǔ)，探索其對(duì)抗D-半乳糖誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的改善作用及機(jī)制。作為衰老的特征之一，線粒體功能障礙在當(dāng)前研究中已被證實(shí)與衰老進(jìn)程存在復(fù)雜關(guān)聯(lián)，如線粒體能量（MMP和ATP）供應(yīng)不足可使機(jī)體代謝能力下降，進(jìn)而發(fā)生一系列衰老變化，其中MMP的降低是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的早期步驟[17-18]。本研究結(jié)果顯示，D-半乳糖處理可導(dǎo)致細(xì)胞MMP和ATP含量顯著降低;而人參總皂苷處理可阻止D-半乳糖導(dǎo)致的MMP降低，與此同時(shí)，人參總皂苷處理還可在一定程度上抑制D-半乳糖導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ATP含量降低。此外，本研究還采用DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)了D-半乳糖處理后細(xì)胞內(nèi)ROS含量。結(jié)果顯示，D-半乳糖處理可顯著升高細(xì)胞內(nèi)ROS含量，但人參總皂苷處理可顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量。以上結(jié)果共同證明了人參總皂苷對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體功能紊亂具有改善作用。

細(xì)胞凋亡是由多種因子或蛋白參與的復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其中抗凋亡蛋白（Bcl-2等）與促凋亡蛋白（如Bax、Cyt-C等）相互作用失衡尤為重要[19]。細(xì)胞凋亡的內(nèi)部途徑是以線粒體為核心因子去激活細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中，會(huì)伴隨著定位于線粒體外膜上的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平顯著下調(diào)、促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平顯著上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)Cyt-C從線粒體向胞漿的大量釋放，誘發(fā)細(xì)胞凋亡;然而，人參總皂苷可有效抑制這些蛋白的異常表達(dá)，從而降低細(xì)胞凋亡率。

Nrf2是細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)，也是氧化還原反應(yīng)的敏感轉(zhuǎn)錄因子，更是抗氧化防御系統(tǒng)中的重要調(diào)節(jié)劑，其可調(diào)節(jié)下游抗氧化蛋白抗氧化酶HO-1、超氧化物歧化酶（SOD）、醌氧化還原酶1（NQO-1）和谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）的表達(dá)而發(fā)揮抗氧化作用[21]。ROS在體內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演著重要的角色，ROS的過(guò)量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致線粒體功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生異常及線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致線粒體凋亡的發(fā)生[22-23]。Nrf2信號(hào)通路作為機(jī)體調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要通路，主要通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化、抗炎及激活解毒蛋白的表達(dá)而發(fā)揮作用[24-25]?；诖耍疚膹腘rf2信號(hào)通路著手，擬通過(guò)上調(diào)機(jī)體抗氧化水平來(lái)對(duì)抗ROS損傷，從而保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)。NAC是一種含巰基的抗氧化劑，具有基于巰基功能的抗氧化特性，能保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷，亦可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[26]。本研究結(jié)果顯示，人參總皂苷可通過(guò)促進(jìn)Nrf2蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)移，提高其下游抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)水平來(lái)抵抗氧化應(yīng)激的發(fā)生;同時(shí)可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax表達(dá)水平抑制線粒體內(nèi)Cyt-C向胞漿釋放，從而減緩細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究初步驗(yàn)證了人參總皂苷能夠通過(guò)激活Nrf2抗氧化信號(hào)途徑拮抗D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、緩解D-半乳糖誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體功能障礙，從而抑制線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，提示人參總皂苷在神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療中存在潛在的應(yīng)用價(jià)值。本文不足之處：人參總皂苷給藥濃度選擇時(shí)，考慮到試驗(yàn)周期長(zhǎng)，藥物濃度會(huì)有浮動(dòng)，所以設(shè)置了兩個(gè)接近的濃度，在后期研究中將予以完善。

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（收稿日期：2020-09-10 修回日期：2020-11-09）

（編輯：鄒麗娟）