文│李靜 宗克新（山東省曹縣畜牧服務(wù)中心） 辛學(xué)強(qiáng)（山東省陽谷縣畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心） 侯敬民 姜利 高玉環(huán) 宇凌（山東省菏澤市動物疫病預(yù)防控制中心）

一、引言

自2018年8月我國遼寧省發(fā)生第一起非洲豬瘟疫情以來，我國多省份相繼發(fā)生非洲豬瘟疫情。為了加強(qiáng)非洲豬瘟的防控，各省強(qiáng)制地市配備了非洲豬瘟檢測設(shè)備，并緊急培訓(xùn)檢測人員，建設(shè)了PCR檢測室。時間緊檢測任務(wù)重，有的檢測室建設(shè)不符合要求，有的檢測人員技術(shù)不過關(guān)、儀器操作不熟練，操作方法不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)龋荒軠?zhǔn)確檢測出病毒核酸，造成了非洲豬瘟檢測比對試驗不能一次通過。

二、非洲豬瘟病毒核酸檢測可能存在的問題

非洲豬瘟病毒核酸檢測可能出現(xiàn)檢測結(jié)果假陰性和假陽性。

1.檢測結(jié)果出現(xiàn)錯誤的原因分析。筆者根據(jù)自身從事RT-PCR檢測10余年積累的經(jīng)驗，分析檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性或假陽性的原因有以下3點：

（1）采樣不規(guī)范。隨機(jī)采樣時不注意仔細(xì)觀察豬的精神狀態(tài)，也沒有按要求逐頭測量體溫，因采樣任務(wù)重，只采集較集中的幾頭，而沒有按要求間隔采集，致使沒有采集到可疑豬只，造成采集的樣本不含有非洲豬瘟病毒。

（2）檢測試劑盒質(zhì)量有問題。我國非洲豬瘟疫暴發(fā)突然，很多廠家一窩蜂似的生產(chǎn)核酸檢測試劑，在短時間內(nèi)迅速獲得批準(zhǔn)文號，但質(zhì)量卻參差不齊。很多試劑盒不設(shè)計提取陽性對照，只設(shè)置反應(yīng)陽性對照，很難驗證提取過程是否能提出病毒核酸。筆者曾做過非洲豬瘟的比對試驗：省比對實驗提供的2個弱陽性樣品，一個稀釋2倍，另一個不做稀釋，提取的病毒DNA模板分別用4種試劑進(jìn)行擴(kuò)增，4個試驗全部出現(xiàn)陽性對照，證明試驗都成立。A試劑結(jié)果為2個樣品可疑，B試劑只檢出未稀釋樣品可疑，C試劑檢測結(jié)果為2個樣品全陰性，D試劑為進(jìn)口試劑，檢測結(jié)果為2個弱陽性。由此可見，部分非洲豬瘟病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒存在質(zhì)量問題，極有可能真正的陽性樣品檢出結(jié)果為假陰性，不能科學(xué)指導(dǎo)非洲豬瘟疫情的防控。

（3）檢測過程存在不符合操作規(guī)程的地方。核酸檢測是微量操作，要求極為嚴(yán)格。首先，人員問題。臨時培訓(xùn)的非洲豬瘟病毒核酸檢測人員，不能正確熟練地使用微量移液槍，不懂得加液時一檔進(jìn)二檔出，槍頭外黏帶的一個液滴就會超過2微升，這樣配制出來的擴(kuò)增體系誤差太大，陽性對照跑不出來曲線，造成試驗不成立，陽性樣品更不會擴(kuò)增出陽性曲線。這樣既浪費了試劑，又延誤了檢測結(jié)果上報時間，不利于疫情防控。其次，微量移液槍使用問題?？h級獸醫(yī)實驗室大多存在經(jīng)費緊張的問題，檢測用的耗材不能足量配備，在做試驗時操作不規(guī)范，移液槍與槍頭不相配造成配液加樣誤差大：如果反應(yīng)液為18微升，RNA模板為2微升，選用20微升的移液槍卻用200微升的槍頭，這樣配制的反應(yīng)體系肯定不是20微升，從而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。再次，配制反應(yīng)體系不嚴(yán)謹(jǐn)。試劑標(biāo)注量不一定精確，每次使用都應(yīng)精密量取，而不應(yīng)該認(rèn)為大差不差就行。有的檢測人員在配制反應(yīng)體系時，不用移液槍量取試劑，不按照試劑瓶標(biāo)注的量進(jìn)行配制，造成擴(kuò)增反應(yīng)體系有很大偏差。最后，常溫操作時間過長。任何PCR檢測的反應(yīng)體系，在常溫下保存時間過長都容易失效。提取儀大多是32份或是36份的，提取96份樣品集中擴(kuò)增要分3次提取，增加了操作時長；另外，反應(yīng)體系配制過早，且分裝速度慢，提取的RNA模板和反應(yīng)體系如果常溫放置時間過長都會造成假陰性出現(xiàn)。

2.檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性的原因分析。通過生物安全大檢查發(fā)現(xiàn)，以下原因可能產(chǎn)生假陽性：

（1）實驗室功能分區(qū)設(shè)計有問題。由于我國非洲豬瘟疫情影響面積大，很多縣級動物疫病預(yù)防控制中心原來沒有分子生物學(xué)檢測室，由于受場地和財政資金的限制，臨時快速建設(shè)的RT-PCR實驗室，個別實驗室不符合非洲豬瘟病毒核酸檢測要求。按分子生物學(xué)檢測要求，PCR檢測實驗室至少分為配液室、核酸提取室、核酸擴(kuò)增室，每個室都應(yīng)有獨立的緩沖區(qū)，且配液室與核酸提取室之間應(yīng)設(shè)置傳遞窗，核酸提取室與核酸擴(kuò)增室不能設(shè)置傳遞窗。

個別實驗室只有2個功能檢測室，即配液與提取在一個房間內(nèi)進(jìn)行，RNA擴(kuò)增在一個房間進(jìn)行。往提取試劑盒中加樣品和配制反應(yīng)體系在同一個生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，很可能給非洲豬瘟病毒核酸擴(kuò)增體系的配制造成污染，使被檢測樣品成為假陽性。

有的實驗室有3個功能分區(qū)，但是各自沒有設(shè)置獨立的緩沖空間，導(dǎo)致PCR實驗室與公共走廊沒有形成有效隔離，這樣也有可能使擴(kuò)增室的高濃度核酸片段以氣溶膠的形式進(jìn)入配液室和核酸提取室，造成樣品污染，出現(xiàn)假陽性。另外，這樣還極有可能使病毒外散，不利于疫情防控。

有的實驗室雖然有3個功能分區(qū)，也有獨立的緩沖間，但是樣品提取與加提取后的模板在同一個生物安全柜內(nèi)同時進(jìn)行，這樣極可能使樣品交叉污染，使檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

（2）檢測人員的影響。有些實驗室因為檢測人員數(shù)量少，檢測人員未嚴(yán)格按照“樣品準(zhǔn)備區(qū)→核酸提取區(qū)→核酸擴(kuò)增區(qū)”的順序定向移動，往往穿著同一套工作服在核酸提取室提取完樣品接著到配液室配液，又到核酸提取室加提取的RNA模板，然后再到核酸擴(kuò)增室到上機(jī)擴(kuò)增，再接著到核酸提取區(qū)室提取下一波樣品。如此反復(fù)，造成人為核酸污染。

非洲豬瘟病毒在我國大面積流行，特別是在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)以畜牧業(yè)為主要經(jīng)濟(jì)來源的地區(qū)，疫情防控更嚴(yán)峻，檢測任務(wù)更繁重。大量的非洲豬瘟病毒核酸檢測，但卻沒有專業(yè)的從業(yè)人員，不少地方現(xiàn)抓人員臨時培訓(xùn)上場，這些人員在短時間內(nèi)操作不規(guī)范也不熟練，不管是樣品核酸提取環(huán)節(jié)，還是擴(kuò)增體系配制環(huán)節(jié)，如果微量移液槍操作不當(dāng)，容易使移液槍與不同試劑和樣品之間發(fā)生交叉污染。有的檢測人員在試驗時移液槍頭掉在生物安全柜臺面上不丟棄，而繼續(xù)使用；有的八聯(lián)排管蓋不倒置或是不小心將八聯(lián)排管蓋掉落在地板上再撿起來用；還有的在加樣時忘記更換槍頭。放置樣品或模板時，由于密封不嚴(yán)而溢于容器外，造成不同樣品或不同模板間產(chǎn)生交叉污染；有的是加好反應(yīng)體系及樣品RNA模板后，八聯(lián)排管蓋不能一次按順序?qū)?yīng)封閉或是封閉不嚴(yán)密，模板之間互相污染。這些都會造成檢測結(jié)果錯誤，導(dǎo)致檢測結(jié)果可能出現(xiàn)假陽性，導(dǎo)致健康的豬群被錯殺，給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

（3）樣品前處理的影響。因非洲豬瘟病毒存在較強(qiáng)的傳染性，且存活時間較長，因此按照操作規(guī)范，樣品在從樣品保存箱取出時應(yīng)對保存箱內(nèi)外及樣品外包裝噴灑乙醇進(jìn)行消毒，然后在水浴中60℃滅活30分鐘。但實際操作中，樣品檢測量極大，為了節(jié)約時間快速出結(jié)果，有的實驗人員不對樣品外包裝進(jìn)行乙醇消毒及滅活。這樣就會污染檢測環(huán)境，極有可能造成樣品間的交叉污染造成假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

（4）試驗后消毒不徹底。每一波試驗結(jié)束后，不對操作臺、移液器、生物安全柜、提取儀等進(jìn)行有效清潔和消毒，導(dǎo)致這些儀器設(shè)備表面殘留樣品污物及核酸片段，給下波試驗造成潛在污染隱患，使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。

三、改進(jìn)的措施及建議

1.國家獸藥監(jiān)管部門和中國動物疫病預(yù)防控制中心規(guī)定非洲豬瘟病毒核酸試劑必須設(shè)置提取陰陽性對照品，并加大對所有試劑產(chǎn)品的抽檢力度。提取陰陽性對照品可以驗證提取過程及配液過程是否有誤，因此必須設(shè)置。國家獸藥監(jiān)管部門在對非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒進(jìn)行抽檢時，應(yīng)對各個廠家的產(chǎn)品進(jìn)行比對，驗證各個廠家的試劑盒是否能檢出非洲豬瘟病毒核酸弱陽性樣品，篩選出合格產(chǎn)品，對不合格產(chǎn)品的廠家責(zé)令限期整改。

2.實驗室嚴(yán)格分區(qū)。病毒核酸檢測實驗室，必須嚴(yán)格按P2實驗室的具體要求設(shè)計建設(shè)，將實驗室嚴(yán)格分隔成配液室、核酸提取室、核酸擴(kuò)增室3個完全獨立的功能室，做到對互不相容活動的相鄰試驗區(qū)域形成真正有效的隔離，設(shè)置傳遞窗口，并安裝紫外燈，防止交叉污染的發(fā)生。

3.省級動物疫病預(yù)防控制中心對市縣級疫控中心加強(qiáng)指導(dǎo)。

（1）規(guī)范非洲豬瘟病毒采樣工作。采樣人員在采樣前采取措施挑選出體溫升高和精神沉郁的豬只，采集血液，屠宰場在屠宰生豬時每一批都應(yīng)采集血槽血。

（2）省級動物疫病預(yù)防控制中心指導(dǎo)市縣兩級疫病預(yù)防控制中心加強(qiáng)對非洲豬瘟病毒核酸檢測人員的培訓(xùn)。用于非洲豬瘟病毒核酸檢測的主要方法是熒光PCR。與其他檢測方法比較，該方法靈敏性高、特異性強(qiáng)，便于快速檢測。由于縣級以下以及部分屠宰場獸醫(yī)實驗室過去較少使用熒光PCR等分子生物學(xué)方法開展大規(guī)模病原學(xué)檢測，還須進(jìn)一步加強(qiáng)培訓(xùn)和實際操作，使其進(jìn)一步熟練掌握該檢測方法。培訓(xùn)要求檢測人員嚴(yán)格按操作規(guī)程對樣品外包裝進(jìn)行消毒，并于60℃水浴鍋或金浴鍋滅活30分鐘。

檢測人員應(yīng)熟知微量移液槍的注意事項，配液加樣時精確操作，一檔進(jìn)二檔出，槍頭外不得黏附液滴，取用20微升以下的液體應(yīng)用20微升以下的移液槍，并應(yīng)用與之相配的20微升槍頭。為防止常溫放置時間過長造成核酸模板失活，應(yīng)將已提取的模板蓋封板膜4℃保存。反應(yīng)體系分裝及加模板時，八聯(lián)排管下應(yīng)放置冰盒，并在加RNA模板時最好使用1～10微升量程的8道移液槍，盡量減少操作時間。同時，人員不能亂竄，應(yīng)該通過傳遞窗傳遞樣品，傳遞時注意相通的窗門不能同時打開。每次試驗前后用75%乙醇或配制好的氫氧化鈉消毒液擦拭工作臺面以及可能接觸到核酸的冰箱、門、窗等把手處、儀器設(shè)備，再用紫外線照射整個實驗工作區(qū)域，不少于30分鐘。試驗產(chǎn)生的廢棄槍頭、EP管等廢棄物應(yīng)置氫氧化鈉消毒液中浸泡12小時以上，在試驗結(jié)束后將所有廢棄物裝入高壓袋內(nèi)密閉121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘，避免污染環(huán)境。