黃 剛,劉聯(lián)斌,劉 彎,林 煒,李遠(yuǎn)香,劉春霞

江西省贛州市腫瘤醫(yī)院檢驗科,江西贛州 341000

侵襲性真菌病是指真菌入侵人體組織或血液,經(jīng)生長繁殖對機體組織、器官功能造成損害，并引發(fā)炎性反應(yīng)的一種感染性疾病,其中以念珠菌為主的酵母樣真菌和曲霉菌為主的絲狀真菌引起的感染最為常見[1-2]。侵襲性真菌病常見于免疫功能低下人群,近年來,隨著腫瘤患者手術(shù)和放化療等治療技術(shù)的廣泛開展,患者受到真菌感染的發(fā)生率呈明顯上升趨勢,如何及時診斷并有效地治療侵襲性真菌病受到越來越多的關(guān)注。目前,真菌檢驗技術(shù)主要包括傳統(tǒng)的真菌涂片鏡檢和真菌培養(yǎng)、組織病理學(xué)檢查、血清學(xué)檢測、分子生物學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)[3]。在歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組(EORTC/IFICG)標(biāo)準(zhǔn)[4]、美國真菌病研究組(MSG)標(biāo)準(zhǔn)[5]、美國抗感染學(xué)會(IDSA)指南[6]、我國《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(第四次修訂版)》[7]中都提到(1,3)-β-D-葡聚糖檢測(G試驗)是臨床診斷侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。本研究對血清降鈣素原(PCT)檢測、G試驗和熒光定量PCR技術(shù)在腫瘤患者侵襲性真菌病早期診斷中的價值進行了探討,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年6月至2018年12月入住本院的合并真菌感染的腫瘤患者25例納入真菌組,包括念珠菌感染13例,曲霉菌感染10例,毛霉菌感染2例,真菌感染診斷標(biāo)準(zhǔn)為放射學(xué)檢查支持存在感染的部位,在無菌術(shù)下取得的標(biāo)本,經(jīng)培養(yǎng)結(jié)果呈陽性。真菌組納入標(biāo)準(zhǔn):符合《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(第四次修訂版)》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)菌感染患者25例納入細(xì)菌組,包括革蘭陰性菌感染16例,革蘭陽性菌感染9例。另選擇同期25例健康體檢者納入對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 PCT檢測采用飛測Ⅲplus儀器,試劑購自廣州萬孚生物技術(shù)有限公司；G試驗采用ELX808鱟試驗檢測儀器,試劑購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；真菌熒光定量PCR檢測采用ABI7500儀器,試劑購自廣州達(dá)安有限公司。

1.3方法 按操作規(guī)程采集靜脈血標(biāo)本進行PCT檢測及G試驗,真菌組同時進行真菌實時熒光定量PCR檢測。通過查找曲霉菌屬、隱球菌屬和真菌通用的基因序列,委托廣州達(dá)安有限公司進行引物設(shè)計,采用ABI7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進行檢測。反應(yīng)程序為37 ℃ 2 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s,55 ℃ 45 s,10個循環(huán)；94 ℃ 20 s,55℃ 45 s,30個循環(huán)。PCR檢測以Ct值<30,且有較好的對數(shù)增長曲線為陽性標(biāo)準(zhǔn)。 血清PCT正常參考范圍為<0.5 ng/mL,(1,3)-β-D-葡聚糖正常參考范圍為<10 pg/mL,大于或等于參考值判斷為陽性。

2 結(jié) 果

2.13組血清PCT、(1,3)-β-D-葡聚糖水平比較 真菌組血清PCT水平稍低于細(xì)菌組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.93,P>0.05)；真菌組血清PCT水平明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=25.70,P<0.05)。真菌組(1,3)-β-D-葡聚糖水平明顯高于細(xì)菌組及對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.85、15.01,P<0.05)。 見表1。

表13組血清PCT、(1,3)-β-D-葡聚糖水平比較

2.23種方法在侵襲性真菌病早期診斷中的價值比較 在真菌組中，實時熒光定量PCR檢測的陽性率高于G試驗和PCT檢測,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.15、22.22,P<0.05)；而G試驗陽性率高于PCT檢測,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.74,P<0.05)。見表2。

表23種方法在侵襲性真菌病早期診斷中的價值比較

3 討 論

腫瘤患者在接受化療后,由于自身免疫力低下容易引起侵襲性真菌病。國內(nèi)外流行病學(xué)研究顯示,血液病及惡性腫瘤患者中侵襲性真菌病的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢,且念珠菌和曲霉菌是侵襲性真菌病最主要的兩種致病菌[8-10]。選擇合適的檢測方法和指標(biāo)對于早期診斷和治療侵襲性真菌病有重要價值。

真菌涂片鏡檢和真菌培養(yǎng)技術(shù)是傳統(tǒng)的真菌檢測方法,仍具有重要價值。但真菌涂片報告需要區(qū)分酵母相及菌絲相,并進行具體描述[11],由于實驗室人員識別能力參差不齊,易造成假陰性。相對于真菌培養(yǎng)技術(shù)耗時較長,組織病理學(xué)檢查取材不便,質(zhì)譜技術(shù)檢測儀器昂貴等原因,血清學(xué)檢測和實時PCR技術(shù)已發(fā)展成熟,采集血液標(biāo)本易于常規(guī)實驗室開展。本研究發(fā)現(xiàn),真菌組(1,3)-β-D-葡聚糖水平明顯高于細(xì)菌組和對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(1,3)-β-D-葡聚糖可用于輔助侵襲性真菌病的早期診斷,這與國內(nèi)大多文獻報道一致[12-15]。本研究提示,真菌組實時熒光定量PCR檢測陽性率高于PCT、(1,3)-β-D-葡聚糖檢測。(1,3)-β-D-葡聚糖檢測是侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一,但隱球菌、結(jié)核分枝桿菌引起的感染G試驗為陰性或輕度升高[16]。PCR技術(shù)具有耗時短,污染少,靈敏度、特異度高,以及重復(fù)性好的特點[17-18],陽性率高于血清PCT和(1,3)-β-D-葡聚糖檢測,在侵襲性真菌病的早期診斷中具有一定價值。

本研究證實了聯(lián)合檢測在侵襲性真菌病早期診斷中的重要價值,但仍需大樣本量的研究來進一步證實。隨著人工智能的不斷發(fā)展,侵襲性真菌病早期診斷技術(shù)將更加快速、準(zhǔn)確。