梁曉東,段如冰,莫淦文,沈炳連,紀 鵬,廖勇彬

廣東省江門市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學診療中心,廣東江門 529030

精子DNA碎片指的是精子成熟過程中在各種因素的作用下,其DNA片段發(fā)生斷裂、交聯(lián)等損傷。當這種存在碎片的精子數(shù)量超過一定程度,可能導致男性不育。而這種精子DNA損傷導致的男性不育通常無法通過常規(guī)的精液分析檢查出來,成為不明原因不育[1]。近年來,輔助生殖技術(ART)的廣泛應用為患者帶來了孕育新生命的希望。在應用ART治療過程中,這些患者的預后與結局受到高度的重視。有研究表明,精子DNA損傷與反復的胚胎質(zhì)量差、種植失敗及流產(chǎn)存在密切的關系[2],但對于精子DNA損傷通過何種途徑影響妊娠結局,以及影響胚胎發(fā)育的哪個階段,目前仍然沒有統(tǒng)一的結論。近年來,把第3天(D3)的胚胎培養(yǎng)成為囊胚,再移植到子宮內(nèi)膜的技術受到生殖界的青睞,囊胚具有種植率高,與子宮內(nèi)膜移植窗口期更為同步等優(yōu)點,成為實驗室開展囊胚培養(yǎng)的著眼點。使用囊胚培養(yǎng)更是能準確地反映和評估胚胎發(fā)育潛能的重要手段[3]。已經(jīng)有學者對精子DNA碎片是否會影響到胚胎的發(fā)育潛能或者影響到卵裂期胚胎發(fā)育成囊胚進行了研究[4-5]。這些研究主要使用單因素分析法,鑒于影響囊胚形成的影響因素眾多,僅使用單因素進行分析有可能造成偏倚,因此,有必要進一步使用多因素分析法分析各因素對囊胚形成的影響,從而觀察DNA完整性對囊胚形成結局的獨立作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧分析2016年1月至2018年12月在本院生殖醫(yī)學診療中心行囊胚培養(yǎng)周期的患者夫婦資料。納入標準:女方年齡≤35歲,受精方式包括常規(guī)體外受精(IVF)和單精子卵漿內(nèi)注射技術(ICSI)。排除標準:(1)經(jīng)皮附睪/睪丸穿刺取精(PESA/TESA)周期；(2)女方卵巢儲備功能低下,參照ZHANG等[6]介紹的標準,基礎竇卵泡數(shù)<5個,或者基礎促卵泡生成素(FSH)>10 U/L,或者曾經(jīng)出現(xiàn)過前一個卵巢刺激周期獲卵數(shù)<5個的卵巢低反應史；(3)卵母細胞冷凍周期。

1.2方法

1.2.1促排卵方案 在促排卵的前1個月經(jīng)周期的黃體中期開始用促性腺釋放激素激動劑(GnRH-a)進行降調(diào)。用GnRH-a后16～20 d,達到降調(diào)標準后使用促性腺激素(Gn)啟動,同時B超監(jiān)測卵泡發(fā)育,并測量血清性激素水平,當至少1個卵泡直徑達18 mm或至少3個卵泡直徑達17 mm時,注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)。注射HCG后34～36 h取卵。

1.2.2精液采集及處理 男方禁欲3～5 d,取卵日用手淫法收集精液。使用上游法或密度梯度離心法處理精液。

1.2.3IVF和胚胎培養(yǎng) 取卵術后,收集和觀察卵母細胞形態(tài),根據(jù)處理后精子數(shù)量選擇IVF方案或者ICSI方案進行受精。若受精率低,則采取補救卵胞漿內(nèi)單精子注射(R-ICSI)方案。受精72 h后觀察D3胚胎情況。

1.2.4囊胚培養(yǎng) 采用Quinn′s Adavantage序貫培養(yǎng)液或Vitrolife序貫培養(yǎng)液對卵裂期胚胎作囊胚培養(yǎng),按試劑說明書操作。第5天(D5)上午進行觀察,若當天形成可用囊胚則移植,若未形成則在第6天(D6)再觀察,若有可用囊胚形成再移植。囊胚的評價標準采用Gardner人類囊胚分級系統(tǒng),D5評分≥3BB、D6評分≥4BB定義為優(yōu)質(zhì)囊胚,D5評分>3CC、D6評分>4CC定義為可用囊胚。

1.2.5精子染色質(zhì)結構分析試驗(SCSA)檢測精子DNA碎片指數(shù)(DFI) 精液液化后用TNE(Tris,NaCl,EDTA)緩沖液進行稀釋,使精子濃度為(1～2)×106/mL,取0.05 mL稀釋后的懸液置于流式細胞儀進樣管中,加入0.1 mL酸處理液處理30 s,再加入0.3 mL吖啶橙染色液,調(diào)整精子流速。檢測5 000個精子的熒光,用軟件分析各種熒光的精子比例,并且計算出DFI。

2 結 果

2.1患者夫婦一般資料 符合條件的患者夫婦的基礎情況見表1。

2.2各組囊胚培養(yǎng)結果 各組的囊胚形成狀況見表2。隨著DFI的升高,囊胚形成率、可用囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率呈現(xiàn)下降趨勢。

表1 患者的基礎條件和獲卵數(shù)

表2 各組囊胚培養(yǎng)結果

注:-表示無數(shù)據(jù)。

2.3多因素回歸分析 把DFI和能夠影響囊胚形成率的其他變量,如女方基礎條件、授精方法，以及男方精子濃度、活力及形態(tài)等作為協(xié)變量,把是否形成囊胚作為因變量進行Logistic多因素回歸模型分析,在模型中把有囊胚形成設定為1,沒有形成囊胚設定為0；把不孕因素中的男方因素設定為1,女方因素設定為2,雙方因素設定為3,其他因素設定為4；把授精方法中的IVF設定為1,ICSI設定為2,R-ICSI設定為3。結果提示精子活力、DFI和授精方式與囊胚形成結局顯著相關(P<0.05),見表3。

表3 囊胚形成多因素Logistic回歸分析

注:-為無數(shù)據(jù)。

3 討 論

精子DNA片段發(fā)生損傷是外界理化因素及內(nèi)在精子缺陷共同作用的結果[7]。較高的精子DNA損傷率可以引起男性不育[8]。而隨著生殖醫(yī)學技術的發(fā)展和進步,不少不孕不育夫婦接受ART而成功妊娠,因此,精子DNA損傷程度對于采取了ART治療后的臨床結局及預后是否也存在著影響,是一個重要的研究課題。目前，已經(jīng)有大量的研究表明,精子DNA損傷與不良的IVF妊娠結局有密切關系[4，9]。

胚胎的體外培養(yǎng)是IVF過程中至關重要的一環(huán),胚胎的質(zhì)量直接影響妊娠結局。利用卵裂期胚胎培養(yǎng)至囊胚階段,觀察其是否形成囊胚或者囊胚是否可用,比起單純的對卵裂期胚胎進行形態(tài)學評估,更能客觀、準確地反映胚胎的質(zhì)量與發(fā)育潛能[3]。因此,本研究通過觀察囊胚培養(yǎng)結局作為胚胎發(fā)育潛能指標來研究精子DNA損傷對其的影響。研究發(fā)現(xiàn),隨著精子DNA損傷程度的升高,囊胚形成率、可用囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率呈現(xiàn)下降趨勢,表明精子DNA碎片能影響卵裂期胚胎發(fā)育到囊胚的過程,與VIRRO 等[10]和NI等[5]的研究結果相同。SIMON等[11]把這種影響稱為胚胎晚期發(fā)育的父源效應。

先前已經(jīng)有研究報道了精子DNA碎片對囊胚發(fā)育的影響[12],然而由于女方年齡、卵巢儲備功能及使用的授精方法也可能影響到囊胚形成結局[13-14],對研究結論造成干擾。為此本研究不但選取了年齡35歲以下、卵巢儲備功能好的女性患者作為研究對象,還把這些因素及授精方法等變量納入Logistic多因素回歸模型進行分析，結果顯示,囊胚形成與授精方式有關,與唐永梅等[15]的研究相符合。除此以外,從模型分析結果還可以看出,男方精液參數(shù)中的精子活力也能影響囊胚形成,可能與精液處理過程中所選擇的方法有關[16]。綜合分析以上因素及模型分析結果,筆者認為DFI是囊胚形成過程中的重要影響因子。

精子DNA損傷能夠廣泛地影響胚胎細胞各個發(fā)育過程,包括受精、細胞分裂、胚胎發(fā)育和著床過程。帶有DNA損傷的精子與卵母細胞受精后,卵母細胞會以有限的修復能力啟動DNA修復程序,但嚴重的DNA損傷卵母細胞無法修復,可能會激活凋亡通路,誘導胚胎凋亡,以上機制可能是影響胚胎發(fā)育潛能的重要機制之一[17]。

綜上所述,本研究探討了精子DNA完整性對囊胚形成的影響,可為今后深入研究精子DNA完整性對囊胚形成的預測價值及作用機制奠定基礎。