劉 煬，劉雙全

1.湖南省婦幼保健院檢驗科，湖南長沙 410008；2.南華大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，湖南衡陽 421001

梅毒是由蒼白螺旋體(密螺旋體屬)感染引起的慢性傳染性疾病，近年來梅毒發(fā)病率不斷攀升，其中約90%以上的患者出現(xiàn)在發(fā)展中國家[1-2]，其以性傳播方式為主的特點使該疾病迅速蔓延，嚴重危害著人類的健康。而我國作為糖尿病大國，糖尿病發(fā)病率也居高不下[3]，同時，糖尿病合并梅毒感染的患者數(shù)也呈增長趨勢，劉煬等[4]和劉雙全[5]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病合并梅毒感染兔比單純糖尿病兔在心臟、肺、肝臟、腎臟等組織均表現(xiàn)出更為嚴重的病理變化，發(fā)生了更為復雜的糖尿病并發(fā)癥，而合并疾病對梅毒病情影響的研究目前尚未開展，本實驗擬通過對比健康兔模型、梅毒感染兔模型，觀察糖尿病合并梅毒感染兔模型梅毒病情的變化情況，為進一步研究其發(fā)病機制，控制傳播及治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 四氧嘧啶、甲苯胺紅不加熱血清試驗(TRUST)檢測試劑盒購自上?？迫A生物技術(shù)有限公司，梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(TPPA)試劑盒購自日本富士瑞必歐株式會社，TRUST檢測儀器購自康健醫(yī)療器械廠，XK95-Ⅰ型多用振蕩器購自江蘇新康儀器廠，甲醛S-P超敏試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，DAB顯色試劑盒均購自Sigma公司；血糖儀(穩(wěn)豪型)為美國強生公司產(chǎn)品，石蠟切片機購自德國Slee公司，顯微鏡購自O(shè)lympus公司；梅毒螺旋體 Nichols標準株來自南華大學病原生物學研究所。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組 成年新西蘭雄兔24只，按照隨機數(shù)字表法分為3組， T組(梅毒感染兔模型組)8只，H組(糖尿病合并梅毒感染兔模型組)8只，C組(健康兔模型組)8只。普通飼料、無抗菌藥物添加，單籠飼養(yǎng)。

1.2.2糖尿病模型建立 H組兔過夜禁食10 h以上，將新鮮的5%四氧嘧啶溶液以0.1 g/kg的用量迅速注射于兔耳緣靜脈。同時C組兔，注等量生理鹽水為對照。所有實驗兔自由飲水活動，密切觀察。每天監(jiān)測兔血糖，待H組兔血糖穩(wěn)定大于 16.0 mmol/L即糖尿病兔模型建立，穩(wěn)定1周后待接種梅毒螺旋體。

1.2.3梅毒感染模型建立 將凍存的感染梅毒螺旋體 Nichols標準株的兔睪丸取出，復蘇后將其接種于健康成年兔睪丸深部，進行3次傳代培養(yǎng)后將菌懸液一次性接種入T組兔和已成為糖尿病模型的H組兔兩側(cè)睪丸，每側(cè)0.5 mL(每毫升約含107個梅毒螺旋體)；C組兔用同樣方法注射同等量的生理鹽水。均給予無抗菌藥物飼料喂養(yǎng)，密切觀察兔睪丸，并用細針吸取組織進行鍍銀染色；同時，每周抽取耳緣靜脈血進行TURST和TPPA。T組兔模型成功建立標準:鍍銀染色檢測到典型梅毒螺旋體，且TPPA檢測顯示陽性。H組兔模型成功標準:血糖穩(wěn)定大于16.0 mmol/L，同時鍍銀染色檢測到典型梅毒螺旋體及TPPA檢測陽性。

1.2.4血清學檢測及睪丸腫脹情況觀察 自梅毒螺旋體接種后，嚴密觀察各組實驗兔睪丸的紅腫變化情況，并每周同時抽取各組兔耳緣靜脈血，室溫放置15 min后，10 000×g條件下離心10 min，取血清進行檢測。依照試劑說明書對所有實驗兔進行TPPA及TRUST滴度檢測。結(jié)果判斷:結(jié)果判斷參照試劑盒說明書,TRUST滴度1∶8以上為陽性；TPPA 滴度1∶80以上為陽性。

1.2.5睪丸組織病理檢測 所有實驗兔經(jīng)13周的飼養(yǎng)，用空氣栓塞法處死，進行病理解剖，以橫斷面取睪丸組織，立即采用10%中性甲醛液將其固定，脫水，包埋，切片后進行HE染色，光學顯微鏡鏡檢并采集圖片。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析，滴度水平比較采用WilcoxonW秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1TPPA、TRUST滴度的變化 T組及H組各8只雄性成年新西蘭兔，TPPA在感染梅毒后的10 d左右呈陽性，并在實驗的整個病程保持陽性(由于目前臨床梅毒病情主要依據(jù)TRUST滴度診斷，本研究并未對TPPA滴度進行統(tǒng)計)。同時T組及H組TRUST滴度不斷上升至最高滴度再下降，兩組各周TRUST滴度比較，第1周和第13周TRUST滴度均為0，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第2周開始至第4周滴度較高，H組比T組TRUST滴度上升更迅速，滴度更高，第2、3周滴度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，第4周差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；自第5周開始滴度下降，H組比T組TRUST滴度維持時間更長，下降速度更緩慢，第5～12周差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；T組和H組均在3周左右達最高滴度。見表1。

2.2睪丸腫脹情況 接種梅毒螺旋體后，T組在第10～14天開始出現(xiàn)睪丸紅腫、變硬現(xiàn)象，第16～24天表現(xiàn)最為明顯，隨后回縮。而H組在第8～12天開始出現(xiàn)睪丸紅腫、變硬現(xiàn)象，第14～28天表現(xiàn)最為明顯，隨后回縮。在TRUST最高滴度時觀察，與C組健康兔相比，T組兔和H組兔睪丸均出現(xiàn)較明顯的腫脹情況(圖1A、B、C)，且H組兔比T組兔睪丸腫脹更明顯，甚至出現(xiàn)明顯水腫、潰爛及鈣化現(xiàn)象(圖1D、E)，而T組未出現(xiàn)。

注:A為C組；B、C為T組；D、E為H組。

圖1TRUST滴度最高時睪丸腫脹變化

2.3睪丸組織病理學改變 光鏡下可見，C組兔睪丸組織無明顯病理改變，見圖2A。病程結(jié)束時，與C組兔相比，T組兔睪丸出現(xiàn)肉芽腫，纖維組織出現(xiàn)增生現(xiàn)象，見圖2B；間質(zhì)組織可見明顯水腫，同時伴有包括淋巴細胞、漿細胞、嗜酸性粒細胞在內(nèi)的較為嚴重的炎性細胞浸潤，組織血管出現(xiàn)輕中度堵塞，見圖2C。而H組的睪丸組織出現(xiàn)多處明顯的纖維增生、間質(zhì)組織水腫，且多呈局灶性出現(xiàn)，見圖2D、E；同時睪丸組織黏液更多，伴大量肉芽腫形成，出現(xiàn)嚴重而多樣的炎性細胞浸潤，除淋巴細胞、漿細胞、嗜酸性粒細胞，還出現(xiàn)單核樣細胞、巨核樣細胞等浸潤，見圖2F；另可見少量結(jié)節(jié)狀壞死灶和閉塞性內(nèi)膜炎改變，并見組織血管出現(xiàn)中重度堵塞，見圖2G。

注:A為C組；B、C為T組；D、E、F、G為H組。

圖2睪丸組織病理學改變

表1 各周T組和H組TRUST滴度水平比較

3 討 論

梅毒作為一種全世界流行的性傳播疾病，引起了全球研究學者的關(guān)注，而恰當?shù)难芯糠椒ㄊ菍嶒灣晒Φ氖滓蛩亍Ｓ捎诿范韭菪w目前無法在體外進行培養(yǎng)繁殖，動物實驗成為主要的研究方法。鼠類個體小，且梅毒感染后生殖器官的變化不明顯，極少用于梅毒的研究；而兔具有個體大、梅毒易感，且梅毒感染的臨床表現(xiàn)易于觀察等特點，是目前梅毒研究的最佳動物模型[6]。梅毒主要通過性傳播感染[2]，本研究模擬梅毒的人類感染途徑，通過將梅毒螺旋體Nichols標準株注入新西蘭兔睪丸組織來使其成功被感染，并表現(xiàn)出睪丸腫大、硬下疳等一系列與人類感染梅毒類似的臨床表現(xiàn)。而糖尿病合并梅毒感染兔模型的建立，采用四氧嘧啶誘導產(chǎn)生超氧自由基破壞胰島β細胞來誘發(fā)糖尿病[7]，構(gòu)建了穩(wěn)定的高血糖狀態(tài)及典型“三多一少”的糖尿病臨床表現(xiàn)。按以上方法接種梅毒螺旋體成功構(gòu)建了糖尿病合并梅毒感染兔模型，為之后的實驗研究提供了更加科學、合理的依據(jù)。

TPPA是一種特異性的梅毒抗原血清學實驗，特異度與靈敏度均較高，為梅毒確診實驗[8]。TRUST是一種非梅毒螺旋體抗原血清實驗，具有檢測迅速，靈敏度高的特點[9]，主要用于梅毒的篩選和療效觀察。臨床上常用TPPA聯(lián)合TRUST來確診梅毒感染[10-11]。本研究全程監(jiān)測各組實驗兔TPPA及TRUST結(jié)果，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，T組及H組TPPA出現(xiàn)陽性均在10 d左右，并在實驗過程中保持陽性，臨床上TPPA多為梅毒確診實驗，而梅毒病情程度評估多采用TRUST滴度檢測，故本研究未對TPPA滴度進行統(tǒng)計，但對TRUST滴度著重進行了分析，比較各周T組和H組TRUST滴度，除特殊幾周，大部分時間H組TRUST滴度水平明顯高于T組。因第1、13周TRUST滴度為0，兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第2周開始至第4周滴度較高，H組比T組TRUST滴度上升更迅速，滴度更高，第2、3周滴度比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，因滴度上升時間的差異，第4周滴度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；自第5周開始滴度下降，H組比T組TRUST滴度維持時間更長，下降速度更緩慢，第5～12周H組TRUST滴度水平明顯高于T組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，比較兩組TRUST最高滴度，與T組相比，H組呈現(xiàn)更高的TRUST滴度峰值。由此可見，糖尿病合并梅毒感染兔表現(xiàn)出更為明顯的梅毒易感性，感染發(fā)展更為迅猛，并出現(xiàn)了更嚴重的梅毒感染。

梅毒是一種慢性性傳播疾病，臨床上可表現(xiàn)為一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒、神經(jīng)梅毒、潛伏梅毒、胎傳梅毒等[12]。其臨床癥狀多從生殖器官開始表現(xiàn)，而男性睪丸病變程度主要由侵入的梅毒螺旋體增殖情況而定，梅毒螺旋體侵入睪丸后主要有5個階段:調(diào)整期(即孵育期)、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期、退行期、潛伏期。調(diào)整期主要出現(xiàn)臨床癥狀不明顯的睪丸炎；隨著生長速度的加快，睪丸炎不斷加重，睪丸出現(xiàn)紅、熱、腫脹等明顯炎性體征，該體征主要見于對數(shù)生長期和穩(wěn)定期；進入退行期，睪丸表現(xiàn)為“樹膠腫”樣損害，睪丸組織硬度增強，其質(zhì)地變得更加堅實，可見大小不一的結(jié)節(jié)[13-15]。本研究以正常睪丸為陰性對照，發(fā)現(xiàn)接種梅毒螺旋體后，T組在第10～14天開始出現(xiàn)睪丸紅腫、變硬現(xiàn)象，第16～24天表現(xiàn)最為明顯，隨后回縮。而H組在第8～12天開始出現(xiàn)睪丸紅腫、變硬現(xiàn)象，第14～28天表現(xiàn)最為明顯，隨后回縮。在TRUST最高滴度時觀察，與C組兔相比，T組兔和H組兔睪丸均出現(xiàn)較明顯的腫脹情況，且H組兔比T組兔睪丸腫脹更明顯，甚至出現(xiàn)明顯水腫、潰爛及鈣化現(xiàn)象，而T組兔未出現(xiàn)以上現(xiàn)象?？梢姡悄虿『喜⒚范靖腥竞?，其梅毒螺旋體繁殖的調(diào)整期縮短，相應的對數(shù)生長期及穩(wěn)定期延長，表明梅毒螺旋體在兔睪丸組織中迅速繁殖的時間提前，繁殖時間及程度均增加，對睪丸的損傷更為嚴重，因此表現(xiàn)出更明顯的癥狀。

梅毒是一種典型的慢性炎性感染性疾病，隨著感染后梅毒螺旋體生長繁殖，睪丸組織可發(fā)生不同程度的病理損傷。龍福泉等[13]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，在梅毒螺旋體靜止生長期，梅毒兔睪丸主要出現(xiàn)睪丸組織血管的輕度增生及炎性細胞的浸潤；隨著梅毒螺旋體迅速生長繁殖，進入穩(wěn)定期，睪丸組織表現(xiàn)出更加明顯的血管增生及大量炎性細胞浸潤；退行期睪丸組織血管壁增厚，血管腔被大量淋巴細胞、漿細胞、嗜酸性粒細胞、炎性細胞浸潤而出現(xiàn)不同程度的堵塞。同時，梅毒早期的睪丸炎主要由轉(zhuǎn)化因子、白細胞介素、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等各種炎性因子及細胞浸潤引起，長期刺激下，至梅毒晚期睪丸組織則發(fā)生水腫、增生、血管堵塞等嚴重病變。本研究通過為期13周的實驗，病程結(jié)束后，檢測各組兔睪丸組織病理變化，發(fā)現(xiàn)與C組兔相比，T組兔睪丸出現(xiàn)肉芽腫、纖維組織增生現(xiàn)象，間質(zhì)組織可見明顯水腫，同時伴有包括淋巴細胞、漿細胞、嗜酸性粒細胞在內(nèi)的較為嚴重的炎性細胞浸潤，組織血管出現(xiàn)輕中度堵塞。H組的睪丸組織出現(xiàn)多處明顯的纖維增生、間質(zhì)組織水腫，且多呈局灶性出現(xiàn)，同時睪丸組織黏液增多，伴大量肉芽腫形成，同時出現(xiàn)嚴重而多樣的炎性細胞浸潤，除淋巴細胞、漿細胞、嗜酸性粒細胞，還出現(xiàn)單核樣細胞、巨核樣細胞等的浸潤，另可見少量結(jié)節(jié)狀壞死灶和閉塞性內(nèi)膜炎改變，并見組織血管出現(xiàn)中重度堵塞。以上研究結(jié)果表明，糖尿病合并梅毒感染兔的睪丸組織表現(xiàn)出更為明顯的病理損傷，且損傷不易逆轉(zhuǎn)，不利于疾病的治療。

綜上所述，糖尿病合并梅毒感染后表現(xiàn)出更為迅速、更為嚴重的感染，加速了疾病進程，加重病情，預后不良，對疾病的預防及治療提出了更加嚴峻的挑戰(zhàn)，提示臨床應更加重視糖尿病合并梅毒感染疾病的發(fā)生、發(fā)展，積極尋找疾病的發(fā)病機制，以更好地對其進行預防和治療，減輕該類患者疾病帶來的痛苦，探索更加行之有效的治療方案。