陸瑋，肖乾，胡燁婷，孔祥興，丁克峰

0 引言

結(jié)直腸癌是威脅人類健康的重大疾病之一，全世界范圍內(nèi)每年約有130萬新發(fā)結(jié)直腸癌患者，約86萬結(jié)直腸癌患者死亡[1]。越來越多的證據(jù)表明，飲食習(xí)慣變化、生活環(huán)境改變、微生物暴露、免疫炎性反應(yīng)、基因改變及表觀遺傳等多種因素在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起推動作用。消化道是人體內(nèi)微生物多樣性和豐度最高的部位之一，目前有很多研究報道了微生物與消化系統(tǒng)疾病之間的密切關(guān)系[2-3]。在結(jié)直腸癌領(lǐng)域，隨著近年來微生物組學(xué)技術(shù)以及生物信息分析方法的發(fā)展，結(jié)直腸癌與正常人群之間腸道菌群多樣性和豐度的差異也被廣泛報道[4-5]；在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中，研究者們發(fā)現(xiàn)微生物通過產(chǎn)生基因毒性物質(zhì)、誘導(dǎo)慢性炎性反應(yīng)、抑制宿主免疫功能等機制，發(fā)揮促進結(jié)直腸癌發(fā)生的作用[6-7]；某些特定細菌如具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum），除了在結(jié)直腸癌患者的原發(fā)灶中富集，還存在于結(jié)直腸癌患者的肝轉(zhuǎn)移灶中[8]；利用結(jié)直腸腫瘤患者與健康人群腸道菌群的差異，研究者們建立了結(jié)直腸腫瘤的早期篩查、診斷模型[9]；微生物不僅能夠參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，還能夠影響結(jié)直腸癌的治療效果[10-11]。本文以微生物與結(jié)直腸癌的關(guān)系為切入點，結(jié)合近年的相關(guān)文獻及自身研究，綜述微生物與結(jié)直腸癌的發(fā)病機制、早期診斷和治療的研究進展。

1 微生物與結(jié)直腸癌的發(fā)病機制

腸道菌群在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們可以產(chǎn)生基因毒性物質(zhì)，直接造成DNA損傷、誘發(fā)基因突變，促進結(jié)直腸癌的發(fā)生[2,12]。Boleij等[12]研究報道，超過80%的結(jié)直腸癌患者腸黏膜中存在產(chǎn)腸毒素的脆弱擬桿菌（enterotoxigenicBacteroides fragilis,ETBF），而脆弱擬桿菌毒素（Bacteroides fragilistoxin,BFT）可以通過升高反應(yīng)活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平造成宿主細胞DNA損傷[13]。一些細菌毒素還含有能夠直接與DNA形成加合物的活性基團，而這種龐大的DNA雙鏈加合物如果不能及時修復(fù)，可能會造成DNA雙鏈斷裂以及基因突變。Wilson等[2]報道，pks島陽性的大腸桿菌（pks+Escherichia coli）可以表達大腸桿菌素活化肽酶（ClbP），其可以促進毒性代謝產(chǎn)物大腸桿菌素（colibactin）的活化，而大腸桿菌素中含有的環(huán)丙烷基團是DNA烷基化基團，其可以與宿主細胞雙鏈DNA交聯(lián)形成烷基化的加合物。大腸桿菌素對宿主DNA的破壞并非隨機而是具有選擇性的，大腸桿菌素選擇性地誘導(dǎo)宿主DNA損傷的序列被稱為大腸桿菌素破壞基序（AAWWTT序列），并且大腸桿菌素破壞基序與結(jié)直腸癌基因組中的突變熱點，尤其是結(jié)直腸癌的關(guān)鍵驅(qū)動基因APC的突變位點高度一致[14]。隨著這些細菌來源的基因毒性物質(zhì)促進結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機制不斷被闡明，它們將來有希望成為結(jié)直腸癌預(yù)防和治療的重要靶點。

炎性反應(yīng)與腫瘤的發(fā)生密不可分，基因毒性物質(zhì)造成的DNA損傷和炎性反應(yīng)互為因果，協(xié)同促進腫瘤發(fā)生[15]。腸道菌群失衡引起的慢性炎性反應(yīng)、局部免疫微環(huán)境紊亂會使腸道黏膜屏障持續(xù)受到破壞，進而使正常腸道上皮細胞、免疫細胞持續(xù)暴露于促腫瘤微生物及其產(chǎn)物中，促進結(jié)腸癌的發(fā)生[16]。Kostic等研究發(fā)現(xiàn)，具核梭桿菌可以誘導(dǎo)宿主細胞高表達COX-2、NF-κB、TNF-α等炎性反應(yīng)相關(guān)基因，促進IL-1β、IL-6、IL-8等促炎細胞因子分泌[17]。除此之外，具核梭桿菌還可以通過招募骨髓來源的抑制性細胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC）、通過其外膜表面的Fap2和RadD蛋白直接誘導(dǎo)淋巴細胞死亡，從而抑制宿主的抗腫瘤免疫功能，促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[17-18]。具核梭桿菌除了在結(jié)直腸癌患者的原發(fā)灶中富集，Bullman等還在結(jié)直腸癌患者的肝轉(zhuǎn)移灶中分離培養(yǎng)得到了具核梭桿菌，并且發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)灶中具核梭桿菌的基因組序列高度相似，相對豐度也較為接近[8]。因此，在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細胞可能與具核梭桿菌等某些特定細菌共同轉(zhuǎn)移至肝臟，形成肝轉(zhuǎn)移灶周圍的微生物微環(huán)境。而目前對于肝轉(zhuǎn)移灶中微生物發(fā)揮的生物學(xué)功能尚無研究報道，探索其是否對晚期結(jié)直腸癌患者具有預(yù)后預(yù)測價值、是否能夠影響化療及靶向治療療效等都將成為今后的研究熱點。

有益的腸道菌群可以產(chǎn)生抗腫瘤物質(zhì)，降低結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險。腸道菌群可以利用膳食纖維發(fā)酵產(chǎn)生丁酸等短鏈脂肪酸，而丁酸可以作為正常腸道上皮細胞的供能物質(zhì)，對于維持上皮細胞的屏障功能以及損傷修復(fù)具有重要作用[19]。Furusawa等研究發(fā)現(xiàn)，丁酸可以提高腸道組織中的Treg細胞FOXP3基因啟動子區(qū)域的組蛋白乙?；?，從而增加FOXP3基因的表達和FOXP3+Treg細胞的比例，抑制結(jié)腸炎癥的形成[20]。丁酸還能夠間接作用于腸道內(nèi)其他細菌，其在高濃度的抗炎作用下會限制其他腸道菌群引起的炎性免疫反應(yīng)，但是其在低濃度時反而會誘發(fā)炎性反應(yīng)，抑制潛在病原體的生長從而恢復(fù)丁酸菌群的豐度[21]。丁酸在不同濃度下的抗炎、促炎雙重作用可能是腸道菌群維持穩(wěn)態(tài)的機制之一。

在結(jié)直腸癌的發(fā)展早期對腸道微環(huán)境進行干預(yù)，可能會降低結(jié)直腸癌的發(fā)生率、延緩結(jié)直腸癌的發(fā)展過程。但是目前對于微生物在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制有待完善，仍然需要在大樣本的人群中進行驗證。未來對于腸道菌群與結(jié)直腸癌相互作用分子機制的進一步闡明，將有助于發(fā)現(xiàn)新的預(yù)防與治療靶點，從而有希望降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率。

2 微生物與結(jié)直腸癌的早期診斷

目前結(jié)直腸癌的診斷流程主要是糞便隱血篩查、電子腸鏡檢查以及病理活檢確診[22]。但是目前的診斷流程仍然存在缺陷，例如糞便隱血篩查的敏感度和特異性較低[23]，電子腸鏡檢查雖然能夠確診結(jié)直腸癌，但是作為侵入性檢查，患者對腸鏡的接受程度以及成本效益關(guān)系決定了腸鏡不適合用于人群結(jié)直腸癌的篩查，而適用于高度懷疑為結(jié)直腸癌患者的確診檢查。因此，尋找更加準確的結(jié)直腸癌篩查、診斷方法是近年來的研究熱點。

2.1 腸道菌群與結(jié)直腸癌的早期診斷

近年來隨著微生物組學(xué)技術(shù)以及生物信息分析方法的發(fā)展，很多大規(guī)模的研究報道了結(jié)直腸癌與健康人之間腸道菌群多樣性和豐度的差異[4-5]。Shah等[24]采用16S rDNA測序分析了結(jié)直腸癌患者與健康人群糞便菌群豐度的差異，鑒定獲得數(shù)十個豐度顯著差異的操作分類單元（operational taxonomic units,OTU），對這些OTU進行注釋發(fā)現(xiàn)它們來源于卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）、胃鏈球菌屬（Peptostreptococcus）、微單胞菌屬（Parvimonas）、阿克曼菌屬（Akkermansia）和梭桿菌屬（Fusobacterium）；利用這些OTU的豐度建立分類預(yù)測模型，能夠較好的區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康人群（AUC=0.76）；除此之外，將OTU的豐度與患者的臨床信息一起納入分類預(yù)測模型，模型的預(yù)測效果可以進一步提升（AUC=0.833）。Yu等[9]采用宏基因組測序分析了中國人群中結(jié)直腸癌患者與健康人群糞便細菌基因的差異，鑒定得到包括來自具核梭桿菌的丁酰CoA脫氫酶在內(nèi)的20個相對表達量具有顯著差異的細菌基因，采用這些細菌基因的相對表達量建立分類預(yù)測模型，也能夠達到區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康人群的效果（AUC=0.71）。除了腸道中的細菌，采用宏基因組測序還可以獲得腸道中的其他微生物的豐度。Nakatsu等[25]還報道了結(jié)直腸癌患者糞便中的噬菌體病毒多樣性顯著高于健康人群，結(jié)直腸癌患者糞便中細菌的多樣性低于健康人群，并且基于結(jié)直腸癌患者與健康人群糞便中豐度顯著差異的病毒例如巨細胞病毒屬（Cytomegalovirus）、正布尼亞病毒屬（Orthobunyavirus）等建立分類預(yù)測模型，也能夠較好地區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康人群（AUC=0.802）。

2.2 口腔菌群與結(jié)直腸癌的早期診斷

除了尋找結(jié)直腸癌患者與健康人群在腸道中顯著差異的微生物，一些研究還報道了結(jié)直腸癌患者身體其他部位、器官的菌群失衡?？谇皇巧舷赖钠鹗迹恳粋€個體都具有獨特的口腔菌群。Russo等[26]報道了結(jié)直腸癌患者口腔中具核梭桿菌的含量較健康人群顯著增加。研究者們還采用了16S rDNA測序技術(shù)對于結(jié)直腸癌患者與健康人群口腔差異菌群進行了探索。Flemer等[27]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者與健康人群口腔菌群顯著差異的OTU主要來源于嗜血桿菌屬（Haemophilus）、胞菌屬（Parvimonas）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、擬普雷沃氏菌屬（Alloprevotella）等菌屬，利用16個顯著差異的OTU的豐度建立分類預(yù)測模型，能夠較好的區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康人群（AUC=0.905）以及結(jié)直腸息肉患者與健康人群（AUC=0.891）。相比于糞便菌群檢測，口腔菌群檢測的便捷性更好，患者的依從性更高，但是飲食習(xí)慣、地域、人種等因素可能會對口腔菌群造成較大影響，此項研究結(jié)果也需要進行多中心的獨立驗證。

2.3 血液游離細菌DNA與結(jié)直腸癌的早期診斷

傳統(tǒng)觀念認為，在沒有系統(tǒng)性感染存在的情況下血液是無菌的。Kowarsky等[28]發(fā)現(xiàn)，健康人群血液中的游離DNA（cell-free DNA,cfDNA）中有約0.5%～10%的讀段無法比對到人的基因組，其中一部分讀段可以比對到細菌、病毒和真菌的基因組。Huang等[29]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血液中的游離DNA中也含有無法比對到人的基因組的讀段，而這些非人源的DNA片段大部分都來源于細菌基因組。我們前期對12例結(jié)直腸癌患者和11例健康人群的cfDNA進行了宏基因組測序，也發(fā)現(xiàn)了其中微量的非宿主來源的DNA片段，它們主要來源于丙酸桿菌屬（Cutibacterium）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、多核桿菌屬（Polynucleobacter）、巴氏桿菌屬（Pasteurella）和腸球菌屬（Enterococcus）等。進一步將這些非宿主來源的DNA片段比對到細菌基因組并進行差異分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者與健康人群的cfDNA存在127個顯著差異的細菌（FDR＜0.1）?；诓町惣毦呢S度數(shù)據(jù)，采用隨機森林模型對這些顯著差異的細菌進行篩選并建立分類預(yù)測模型，最終納入分類預(yù)測模型的細菌共有28個。我們將該模型在另一批樣本中進行獨立驗證，共包含13例結(jié)直腸癌患者、10例結(jié)直腸腺瘤患者和11例健康人群，并計算每個個體患結(jié)直腸癌的概率。我們發(fā)現(xiàn)該模型不僅能夠很好的區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康人群（AUC=1），也能夠很好的區(qū)分結(jié)直腸腺瘤患者與健康人群（AUC=1）。該研究尚未正式發(fā)表，可在預(yù)印本網(wǎng)站BioRxiv查詢相關(guān)結(jié)果（https://www.biorxiv.org/content/10.1104/647644v1）。

采用cfDNA中細菌DNA的豐度對結(jié)直腸癌進行早期診斷是一個新興領(lǐng)域，其具有非侵入性、患者依從性高、準確率高等特點，并且結(jié)直腸腺瘤也能在該分類預(yù)測模型中得到很好的識別。但是目前我們對于這些細菌DNA的來源仍然未知，雖然我們發(fā)現(xiàn)它們與胃腸道的菌群存在一部分重合，提示它們可能來源于受損的消化道黏膜屏障，但是全身其他部位與器官常駐細菌的DNA也能夠在血液中檢測到，提示cfDNA中細菌DNA可能是全身各個部位細菌DNA的綜合。在血液循環(huán)中，僅僅存在細菌的DNA還是有存活細菌尚未知，鑒于Bullman等[8]報道結(jié)直腸癌肝臟轉(zhuǎn)移灶中也有可培養(yǎng)的活細菌存在，因此在血液循環(huán)中很可能有微量的存活細菌，而它們是否發(fā)揮了生物學(xué)功能仍然未知。此外，年齡、地域、人種等混雜因素可能會對cfDNA中細菌的組成造成影響，cfDNA中細菌成分用于結(jié)直腸癌早期診斷的結(jié)果未來也需要多中心研究進行獨立驗證。

3 微生物與結(jié)直腸癌的治療

隨著微生物促進結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制研究不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)某些微生物可能成為抑制結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的藥物靶點。Cougnoux等以大腸桿菌素活化肽酶為靶點，篩選了2種小分子抑制劑，在體外實驗中它們能夠減弱pks+E.coli的基因毒性、逆轉(zhuǎn)宿主細胞的DNA損傷，并且它們在小鼠模型中還可以抑制pks+ E.coli誘導(dǎo)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生率[30]。具核梭桿菌是革蘭氏陰性專性厭氧菌，對于甲硝唑敏感。Bullman等采用具核梭桿菌陽性的結(jié)直腸癌組織樣本建立了人源腫瘤異體移植小鼠模型（patient-derived tumor xenograft,PDX），發(fā)現(xiàn)甲硝唑能夠顯著抑制具核梭桿菌的載量和腫瘤組織的生長[8]。但由于甲硝唑除了能夠殺死具核梭桿菌還會殺死其他厭氧菌，因此研發(fā)具核梭桿菌特異的抗菌藥物將更具有臨床實用價值。除了直接以細菌作為靶點進行藥物研發(fā)，細菌調(diào)控腫瘤細胞發(fā)生改變的信號通路也可以作為靶點。具核梭桿菌能夠激活結(jié)直腸癌細胞的TLR4/MyD88信號通路，從而促進結(jié)直腸癌細胞的自噬水平并抑制奧沙利鉑（oxaliplatin）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）誘導(dǎo)的促腫瘤細胞凋亡作用，從而引起腫瘤耐藥[11]。抑制具核梭桿菌引起結(jié)直腸癌細胞升高的自噬水平，也是增加結(jié)直腸癌化療敏感度的新策略之一。

除了作用于腫瘤細胞影響化療敏感度，一些微生物可以使化療藥物或其代謝產(chǎn)物的活性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致化療藥物的不良反應(yīng)增強。如伊立替康（irinotecan）是晚期結(jié)直腸癌患者常用的化療藥物，伊立替康會經(jīng)肝臟的羧酸酯酶（carboxylesterase）代謝成為抗腫瘤活性產(chǎn)物SN-38，而SN-38會被藥物代謝Ⅱ相反應(yīng)中的關(guān)鍵酶UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyltransferase,UGT）代謝成為失活產(chǎn)物SN-38G，并通過膽汁分泌進入腸道；而大腸桿菌產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase），可以催化腸道內(nèi)的失活產(chǎn)物SN-38G重新轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚援a(chǎn)物SN-38，從而引起嚴重腹瀉等不良反應(yīng)[10,31]。以β-葡萄糖醛酸苷酶作為靶點設(shè)計的小分子抑制劑，目前已經(jīng)在動物實驗中被證明，其在不影響伊立替康抗腫瘤活性的同時能降低伊立替康導(dǎo)致的嚴重腹瀉等不良反應(yīng)[32]。

目前許多研究報道了某些特定微生物的促結(jié)直腸癌作用，而益生菌等微生物制劑能夠促進腸道微生物恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，那么這些微生物制劑能否輔助結(jié)直腸癌的治療呢？Gao等報道，益生菌補充療法能夠改善結(jié)直腸癌患者腸道菌群的多樣性，并且能夠顯著降低促進結(jié)直腸癌的梭桿菌屬細菌的豐度達5倍以上[33]；除此之外，益生菌還可以通過下調(diào)宿主細胞COX-2的表達水平，抑制腸道內(nèi)的免疫炎性反應(yīng)從而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生[34]。雖然目前關(guān)于益生菌等微生物制劑抑制結(jié)直腸癌的作用和分子機制已經(jīng)在細胞、動物模型中取得很多研究進展，但是未來仍然需要在人群中進行大量的隨機對照試驗。傳統(tǒng)的微生物制劑成分較為單一，很多益生菌在患者腸道中無法長期存活，而糞菌移植可以將健康人群的腸道菌群移植到患者的腸道中，其作為一項新興技術(shù)，已經(jīng)在炎性腸病等疾病中取得較多進展[35]。但是，糞菌移植能否應(yīng)用于結(jié)直腸癌治療，目前還缺少臨床實踐的證據(jù)，并且對于供體的選擇、糞菌移植的時機等目前尚無定論，在將來這些可能是微生物用于結(jié)直腸癌治療的重點研究方向。

4 結(jié)論

綜上所述，微生物與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的密不可分，對于該領(lǐng)域的探索，有助于更好地認識結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，使早期干預(yù)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展成為可能；利用結(jié)直腸癌患者與健康人群之間的差異微生物，建立基于微生物標志物的結(jié)直腸腫瘤早期篩查、診斷模型，有助于結(jié)直腸腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)；以微生物作為靶點研發(fā)藥物、恢復(fù)腸道微生物穩(wěn)態(tài)，可能在今后成為結(jié)直腸癌預(yù)防和治療的新策略。