林標聲, 呂正陽, 羅茂春, 何玉琴, 林占熺

(1.龍巖學院生命科學學院 福建 龍巖 364012；2.福建農(nóng)林大學生命科學學院 福建 福州 350002； 3.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002)

nifH基因是固氮微生物中最保守的功能基因之一，是許多固氮微生物的主要固氮基因；作為編碼固氮酶的結(jié)構(gòu)基因，nifH基因在生物固氮過程中發(fā)揮著重要作用[1].nifH基因在不同微生物菌株中廣泛存在，如克雷伯氏菌屬(Klebsiella)[2]、芽孢桿菌屬(Bacillus)[3]的細菌，是學者研究微生物固氮功能基因的主要對象，常用于研究不同類型來源固氮微生物的系統(tǒng)發(fā)育和多樣性[4].

氮元素是構(gòu)成生命體的最重要基本成分之一，是影響植物生長發(fā)育的重要影響因子.生物固氮是許多植物獲得氮素的重要途徑，其經(jīng)濟、無污染，是近年來農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點[5].一些禾本科植物的內(nèi)生固氮菌可以為植物提供超過60%的氮素，但其固氮效率與植物所處的氮水平具有一定的關(guān)聯(lián)性，如有些基因會隨著植物土壤環(huán)境中氮的輸入而發(fā)生固氮水平的變化[6].因此，了解這些內(nèi)生固氮菌主要固氮基因nifH在不同氮水平條件下的差異表達，對認識植物響應(yīng)不同土壤氮源環(huán)境條件下的分子調(diào)控機制具有十分重要的意義[7].

實時熒光定量PCR技術(shù)(real-time quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)效率高、靈敏度高、定量準確，近年來廣泛應(yīng)用在基因表達分析領(lǐng)域[8].蛋白質(zhì)印跡(Western blot)是一種在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的免疫生化技術(shù)，其根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合，可對目的蛋白進行定性和半定量分析，是蛋白組學領(lǐng)域的一項關(guān)鍵技術(shù)[9].Western blot技術(shù)與實時熒光定量PCR技術(shù)的聯(lián)合使用常用于特定目的基因的表達與分析，是近年來研究應(yīng)用的熱點技術(shù)[10-11].

巨菌草(Pennisetumgiganteum)為多年生禾本科牧草，隸屬于狼尾草屬，根系發(fā)達，抗旱性極強，具有較強的防風固沙的生態(tài)治理功能，是一種具有良好應(yīng)用潛力的能源草、生態(tài)草[12].本實驗室前期通過對巨菌草內(nèi)生固氮菌群的高通量測序分析，已探明巨菌草種植成熟期的根部具有豐富的內(nèi)生固氮菌群，其種類及豐度均超過了其他時期的莖部和葉部，是重要的內(nèi)生固氮菌群分離資源[13]，現(xiàn)已從中分離得到一株具有較強固氮能力、促生性能的菌株GN02，經(jīng)鑒定為變棲克雷伯氏菌(KlebsiellavariicolaRosenblueth).本試驗采用qRT-PCR技術(shù)及Western blot技術(shù)研究氮源對巨菌草內(nèi)生固氮菌K.variicolaGN02nifH基因表達的影響，可為進一步探究巨菌草及其他禾本科植物內(nèi)生固氮菌固氮酶基因的分子結(jié)構(gòu)、固氮酶變化及在不同氮條件下的分子調(diào)控、氮代謝及與作物互作的機制等研究提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

菌株K.variicolaGN02為本實驗室前期從巨菌草成熟期根部分離出的一類菌株，經(jīng)菌落形態(tài)分析、基因組測序和促生性能鑒定后認定為K.variicolaGN02，現(xiàn)保管于中國普通微生物菌種保藏管理中心(保藏編號CGMCC 1.13619)；Ashby無氮培養(yǎng)基成分如下：甘露醇10 g·L-1，KH2PO40.2 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，NaCl 0.2 g·L-1，CaSO4·2H2O 0.1 g·L-1，CaCO35.0 g·L-1，pH值7.0～7.2；LB液體培養(yǎng)基干粉購自北京索萊寶科技有限公司，按說明書配置.

1.2 主要試劑

細菌DNA提取試劑盒(Q5822)購自天根生化科技(北京)有限公司，細菌RNA提取試劑盒(R101-01)和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AH101-02)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，各DNA marker、限制性內(nèi)切酶、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑、各限制性內(nèi)切酶、Tag酶均購自寶生物工程(大連)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純，引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成.細菌總蛋白提取試劑盒(C600596)購自生工生物工程(上海)股份有限公司，一抗AS01-021雞抗固氮酶(nifH)多克隆抗體購自艾美捷科技(武漢)有限公司，二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗兔Ig(HS131-01)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，BCA蛋測定試劑盒(PC0020)購自北京索萊寶科技有限公司.

1.3 不同氮源條件下的菌株培養(yǎng)

將保存的GN02菌株分別培養(yǎng)于Ashby無氮液體培養(yǎng)基和LB含氮液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期；取菌液，4 000 r·min-1離心得菌體.無氮培養(yǎng)基和含氮培養(yǎng)基樣品各取3組，共6個樣品.

1.4 nifH基因的克隆及同源進化分析

取6個培養(yǎng)的GN02菌株樣本提取DNA，根據(jù)細菌DNA提取試劑盒說明操作，參考文獻[2]設(shè)計nifH基因擴增的核苷酸序列引物，其中F:5′-TTATACTACAGGAGCTTCAG-3′，R：5′-ATGACAGACGAAAACATTAG-3′.PCR反應(yīng)總體系20 μL，其中核糖核酸酶游離水6.4 μL、DNA模板1.2 μL、Primer F(10 μmoL·L-1) 1.2 μL、Primer R(10 μmoL·L-1)1.2 μL、2×Taq dye PCR master mix 10.0 μL.PCR程序為：94 ℃ 8 min，94 ℃1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)后72 ℃延伸10 min.瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物片段大小，經(jīng)凝膠回收純化后送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進行測序.將測序的結(jié)果在NCBI登錄，并進行BLAST比對.采用MEGA6軟件鄰接法(NJ法)構(gòu)建nifH基因同源進化樹.

1.5 總RNA提取及cDNA的合成

取6個培養(yǎng)的GN02菌株樣本提取總RNA，按細菌RNA提取試劑盒說明操作，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取樣本的完整性，紫外分光光度計測定其濃度和D260nm/D280nm.

各樣品的總RNA經(jīng)檢測合格并定量后，各取2.5 μg用于反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體操作參考提取試劑盒說明.反轉(zhuǎn)錄總體系20 μL，其中RNA 5.0 μL、3′端引物 2.0 μL、10 mmoL·L-1DNTP 1.0 μL、10×TS Ⅱ RT Buffer 2.0 μL、 核糖核酸酶抑制劑0.5 μL、TransScript Ⅱ RT 1.0 μL、核糖核酸酶游離水8.5 μL.將無氮培養(yǎng)基和含氮培養(yǎng)基樣品各取一個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，參考文獻[14]設(shè)計16S及nifH兩對引物分別做PCR.引物序列分別為：16S-F：5′-AGGAAGGTGGGGATGACGTC-3′、16S-R：5′-CTAGCGATTCCGACTTCATGC-3′,nifH-F：5′-TTATACTACAGGAGCTTCAG-3′、nifH-R：5′-ATGACAGACGAAAACATTAG-3′.

PCR反應(yīng)總體系30 μL，其中pfu Tag mix 15.0 μL、Primer F(10 μmoL·L-1)1.5 μL、Primer R(10 μmoL·L-1)1.5 μL、ddH2O 11.0 μL、DNA模板1.0 μL.PCR程序為：94 ℃120 s，94 ℃ 30 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，33個循環(huán)后72 ℃延伸300 s.PCR結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物片段大小.

1.6 nifH基因的qRT-PCR分析

將6個樣品cDNA合成產(chǎn)物作為模板，再用16S及nifH兩對引物分別做qRT-PCR，按上述的PCR反應(yīng)體系和程序進行，試驗重復(fù)3次.溶解曲線的分析參考儀器說明：65 ℃上升至95 ℃，每個梯度0.5 ℃，保溫10 s，自動采集熒光.基因表達量以相對熒光單位(relative fluorescence unit, RFU)表示.溶解曲線中熒光強度隨溫度的改變以RFU對溫度進行一次求導(dǎo)的負數(shù)-d(RFU)/dT表示.

1.7 Western blot檢測nifH蛋白的表達

根據(jù)細菌總蛋白提取試劑盒說明操作，將培養(yǎng)結(jié)束后的6個GN02菌株樣本分別轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，6 000 r·min-1離心1 min后收集菌體細胞；用預(yù)冷至4 ℃的PBS溶液洗滌2～3遍，去除洗液后，輕微波動菌體，分散菌體細胞；將含菌體細胞的EP管放入碎冰中預(yù)冷，加入100 μL RIPA細胞裂解液，冰上裂解3 min，再于4 ℃ 12 000 r·min-1離心20 min；將離心后的上清液轉(zhuǎn)至1.5 mL的EP管中，BCA法測定各樣本的蛋白濃度，按李佳慧[10]等的方法進行Western blot檢測，其中內(nèi)參為nifH多克隆抗體、ECL顯色液顯色，用ChemiDoc MP成像儀系統(tǒng)(Bio-Rad, USA)觀察；采用Quantiyone軟件對所獲得的Western blot條帶進行灰度分析值計算，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值計算各樣品的nifH蛋白相對表達量.

2 結(jié)果與分析

2.1 nifH基因的克隆及同源性分析

由圖1可得，6個樣本的GN02菌株擴增產(chǎn)物在880 bp左右，與預(yù)期的nifH基因片段長度一致，表明GN02菌株在無氮和含氮條件下均可擴增出nifH條帶；回收純化后克隆測序并通過NCBI-BLAST分析，結(jié)果顯示該序列與Genbank多個物種的nifH基因序列高度相似，表明克隆得到的序列為的固氮細菌的nifH基因.將獲得的序列提交NCBI，登錄號為MK131264，經(jīng)BLAST比對，NJ法構(gòu)建GN02菌株的同源進化樹，結(jié)果如圖2所示.結(jié)果表明，巨菌草內(nèi)生固氮菌K.variicolaGN02的nifH基因與甘蔗來源的nifH基因(CP009274.2KlebsiellavariicolStrain_DX120E)親緣關(guān)系最近(ident 99.94%)，可能是由于巨菌草和甘蔗均同屬于禾本科屬植物，其內(nèi)生固氮菌的菌群組成、定殖部位及定殖方式更為接近，所以兩者固氮基因也更為相近[9].

2.2 基因組總RNA提取

6個樣品總提取的RNA濃度約為400 ng·μL-1，D260nm/D280nm均在2.0左右.由圖3可得，各樣本電泳條帶清晰，23S RNA的亮度是16S RNA亮度的2倍，表明各樣品總RNA提取質(zhì)量較高，可用于后續(xù)的cDNA合成.兩組樣品的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)16S及nifH兩對引物分別做PCR后的電泳圖如圖4所示，結(jié)果表明，所用兩對引物均能在PCR中特異性擴增各樣本的目的片段，可進行下一步的qRT-PCR分析.

2.3 氮對nifH基因的表達影響

GN02菌株nifH基因的qRT-PCR表達水平分析結(jié)果如圖5～7所示，各樣本擴增曲線平滑，擴增曲線CT值范圍為14～26；各樣本的16S引物擴增的溶解溫度為87 ℃，nifH引物擴增的溶解溫度為82 ℃；溶解曲線均為單一尖銳峰，表明各擴增產(chǎn)物單一、穩(wěn)定、復(fù)性好，結(jié)果準確可靠，所得數(shù)據(jù)可用于下一步的分析.

圖1 GN02菌株nifH基因PCR電泳圖
Fig.1 PCR electrophoretogram of thenifH gene from strain GN02

圖2 GN02菌株nifH基因系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.2 Phylogenetic tree of thenifH gene from strain GN02

M：Marker DL2000；1～3 ：無氮培養(yǎng)基的菌株培養(yǎng)樣本； 4～6：含氮培養(yǎng)基的菌株培養(yǎng)樣本.
圖3 GN02菌株兩類培養(yǎng)基上培養(yǎng)提取樣本的RNA電泳圖
Fig.3 Electrophoretogram of RNA extracted fromK.variicolaGN02 cultivated under different medium

M： Marker DL2000；1、3：16S引物擴增；2、4：nifH引物擴增.
圖4 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)16S及nifH擴增的電泳圖
Fig.4 Electrophoretogram of reverse transcription products amplified by 16S andnifH

圖6 16S引物擴增的溶解曲線
Fig.6 Dissolution curve of the amplificated 16S primer

圖7nifH引物擴增的溶解曲線
Fig.7 Dissolution curve of the amplificatednifH primer

根據(jù)擴增曲線，計算各樣本16S引物擴增和nifH引物擴增的CT值，再根據(jù)CT值計算GN02菌株nifH基因的表達量，結(jié)果如表1所示.結(jié)果表明，在無氮培養(yǎng)基中，GN02菌株nifH基因的相對表達量為16S基因相對表達量的0.901 3倍，在含氮培養(yǎng)基中為0.054 4倍，說明nifH基因在無氮培養(yǎng)基中的表達顯著高于在含氮培養(yǎng)基的表達量，且差異達到極顯著水平(P<0.01).

表1 兩類氮水平培養(yǎng)基中nifH基因的表達分析1)Table 1 Expression analysis of nifH gene under media with divergent nitrogen contents

1)相對表達量=log2(CT差值)， **表示差異極顯著(P<0.01).

2.4 氮對nifH蛋白表達的影響

由圖8可得，各樣本nifH目的蛋白及內(nèi)參基因的表達量穩(wěn)定，nifH目的蛋白的相對表達量在無氮培養(yǎng)基中為3.28±0.15，顯著高于含氮培養(yǎng)基中的表達量(P<0.05).nifH蛋白表達結(jié)果與其基因的表達結(jié)果一致.表明含氮條件下，nifH基因的表達確實受到了抑制.

3 討論

迄今為止，nifH基因的固氮機制尚未清楚，其固氮酶活性的作用機理也有待進一步分析研究.許多研究表明，外界條件因素特別是環(huán)境中氮(銨)對固氮菌株的固氮酶活性或nifH基因的表達影響顯著，如嚴君[15]等的研究表明，添加任何形式的氮肥均會抑制大豆根瘤菌的活性；Dedysh et al[16]的研究表明，嗜酸型甲烷營養(yǎng)細菌在有氧無氮培養(yǎng)基中生長活躍，nifH基因表達水平活躍.總之，氮(銨)對活體固氮微生物酶活性具有抑制作用，其抑制活性的大小與固氮菌株所處的各種內(nèi)外在因素有關(guān)，如固氮菌株的類型、體內(nèi)外的營養(yǎng)因素、菌株細胞膜受影響的程度等，至于這種抑制的機理、是否可逆、作用的時效性等還有待進一步探討[17].

本試驗表明，GN02菌株在無氮和含氮條件下培養(yǎng)均有nifH基因表達，克隆得到的nifH基因與同為禾本科植物甘蔗來源nifH基因親緣關(guān)系較近；但在無氮培養(yǎng)條件下，其nifH基因及蛋白的表達量明顯高于含氮條件下的表達量，且差異均達到顯著水平(P<0.05).表明無氮條件能誘導(dǎo)GN02菌株nifH基因表達量的增加，而含氮源條件下nifH基因的表達受到抑制，與前人對其他禾本科植物固氮菌的研究結(jié)論一致；也因而驗證了在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對含固氮菌的一些作物施肥時，過量的氮肥對固氮菌固氮酶活性有一定的抑制作用(如影響根瘤的形成及侵染)，氮肥的施用應(yīng)綜合考慮、合理安排[18].