林 蔚， 王晶晶， 何官榕， 劉 爽， 蘭思仁,5

(1.福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基因組與生物技術(shù)研究中心;2.福建農(nóng)林大學(xué)蘭科植物 保護(hù)與利用國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院；4.福建農(nóng)林大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院；5.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院，福建 福州 350002)

金線蓮[Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl.]為蘭科開唇蘭屬植物，是一種多年生珍稀名貴中草藥[1-2],富含多糖、微量元素、強(qiáng)心苷類化合物、氨基酸、有機(jī)酸、甾體化合物、黃酮類化合物、生物堿等多種成分[3-5].近年的研究表明,金線蓮多糖具有提高免疫力、清除自由基[6-7]、提高抑瘤活性、抗氧化、保護(hù)肝臟及降血糖[8-10]的功能.前人[1，11-13]對(duì)金線蓮的組培快繁、多糖提取工藝、栽培模式等進(jìn)行了初步研究，但對(duì)不同栽培模式下不同組織多糖含量的研究較少.因此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)金線蓮不同種源、栽培模式、栽培時(shí)間及不同組織多糖含量的變化進(jìn)行了研究，了解不同培養(yǎng)方式下，人工培育金線蓮的多糖累積規(guī)律，同時(shí)對(duì)多倍體金線蓮、水培金線蓮的多糖含量也進(jìn)行了研究，旨在為金線蓮多糖的高效提取及其藥用價(jià)值的開發(fā)應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 不同種源的金線蓮 以來(lái)源于福建寧德(綠色圓葉)、福州閩侯(圓葉)、漳州(尖葉)的繁殖培養(yǎng)3個(gè)月的金線蓮瓶苗為研究材料(圖1).

1.1.2 不同栽培模式、栽培時(shí)間金線蓮植株的選取 以來(lái)源于寧德的繁殖培養(yǎng)3個(gè)月的金線蓮瓶苗為研究材料，分別為闊葉林林下栽培苗、繁殖瓶苗、大棚栽培苗(圖2)，栽培時(shí)間分別為1、3、6個(gè)月，測(cè)定金線蓮全株的多糖含量.林下栽培在福建永泰赤壁自然保護(hù)區(qū)進(jìn)行；繁殖瓶苗、大棚栽培在福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院設(shè)施科學(xué)與工程系實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行.

1.1.3 蕾期、花期金線蓮不同組織材料的選取 以來(lái)源于寧德的繁殖培養(yǎng)3個(gè)月的金線蓮瓶苗為研究材料，仿生種植于永泰赤壁自然保護(hù)區(qū)闊葉林林下12個(gè)月，分別于蕾期、花期取材，選取材料如圖3所示.

1.2 樣品制備

將新鮮金線蓮材料洗凈并剪碎后取0.1～0.3 g置于試管(或大離心管)中，加入10 mL蒸餾水，用塑料薄膜封口后在沸水浴中提取30 min(提取2次).將提取液過(guò)濾至容量瓶中，反復(fù)漂洗試管及殘?jiān)?，定容?5 mL，即為待測(cè)液.

1.3 多糖含量的測(cè)定

采用蒽酮—硫酸法[14測(cè)定多糖含量.精密吸取0.4 mL多糖溶液于試管中，加入0.6 mL蒸餾水、0.5 mL蒽酮乙酸乙酯(1.0 mg·mL-1)、5 mL濃硫酸(80%)，在恒溫水浴鍋中沸水浴2 min，冷卻至室溫，搖勻備用.以不加多糖的樣本作為空白對(duì)照，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(D)，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖質(zhì)量.多糖含量/%=(A×V1×N)/(W×V2)×100.式中：A為回歸方程計(jì)算出的多糖質(zhì)量；V1為樣品定容的體積；N為擴(kuò)大倍數(shù)；W為樣品質(zhì)量;V2為測(cè)定取用的樣品提取液的體積.

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用SPSS 23軟件進(jìn)行顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種源金線蓮多糖含量的差異

分別以來(lái)源于寧德、福州閩侯、漳州3個(gè)地區(qū)的繁殖培養(yǎng)3個(gè)月的金線蓮瓶苗測(cè)定多糖含量.結(jié)果(圖4)顯示，不同種源多糖含量的大小為：漳州>寧德>福州閩侯，且差異顯著.漳州種源金線蓮的多糖含量最高，達(dá)到7.15%，而福州閩侯種源僅為3.40%.可見(jiàn)，不同種源金線蓮的多糖含量存在顯著差異，漳州種源的多糖含量最高.

2.2 不同栽培模式、栽培時(shí)間下金線蓮多糖含量的差異

圖5顯示，不同栽培模式下分別栽培1、3、6個(gè)月的金線蓮多糖含量，均以闊葉林林下栽培苗的最高，且顯著高于大棚栽培苗、繁殖瓶苗.林下栽培3個(gè)月的多糖含量最高，達(dá)19.25%；大棚栽培苗、繁殖瓶苗的多糖含量隨著種植時(shí)間的增加不斷增大，在栽培6個(gè)月時(shí)達(dá)到最大值，多糖含量分別為5.35%和7.15%.將3個(gè)栽培模式進(jìn)行總體比較，發(fā)現(xiàn)隨著栽培時(shí)間的增加，多糖含量大小的整體趨勢(shì)為：林下栽培苗>繁殖瓶苗>大棚栽培苗.寧德種源金線蓮在栽培1個(gè)月的多糖含量就可以從7%上升到17%，是值得研究的重點(diǎn).

2.3 金線蓮不同栽培模式下不同組織多糖含量的差異

2.3.1 多倍體金線蓮不同組織的多糖含量 多倍體金線蓮的莖節(jié)較二倍體增多、增大、增粗，纖維增多，葉片數(shù)量增多變小，適應(yīng)性強(qiáng)，抗病蟲害能力強(qiáng).圖6顯示，栽培3個(gè)月的多倍體金線蓮不同組織多糖含量的大小為：莖>根>葉，各組織的多糖含量差異顯著，其中以莖的多糖含量最高，達(dá)6.12%，根為5.79%.可見(jiàn)，多倍體金線蓮的多糖主要集中在根、莖部，葉片相對(duì)較少.

2.3.2 平地栽培蕾期、花期金線蓮不同組織的多糖含量 栽種于永泰赤壁自然保護(hù)區(qū)的金線蓮長(zhǎng)至開花的時(shí)間需要一年以上，分別取處于蕾期的花蕾、莖、葉、根以及花期開放的花(整個(gè)花序)、莖、葉、根測(cè)定多糖含量.結(jié)果表明：蕾期不同組織的多糖含量均顯著高于花期，即隨著花的開放，植株整體的多糖含量下降(圖7).種源對(duì)金線蓮的多糖含量也有影響，如福州閩侯種源的金線蓮，其莖、葉的多糖含量顯著低于廣西種源的金線蓮，而根部的多糖含量顯著高于廣西種源的金線蓮(圖8).

圖柱上附不同字母者表示差異顯著(P<0.05).
圖7 金線蓮不同組織的多糖含量
Fig.7 Polysaccharide contents of different tissues ofA.roxburghii

圖柱上附不同字母者表示差異顯著(P<0.05).
圖8 不同種源金線蓮的多糖含量
Fig.8 Polysaccharide contents ofA.roxburghiifrom different provenances

2.3.3 水培金線蓮不同組織的多糖含量 金線蓮水培3個(gè)月后，其莖、葉的多糖含量顯著高于根部(圖9)，此時(shí)莖、葉的多糖含量達(dá)到13.26%，僅次于林下栽培6個(gè)月的苗，顯著高于栽培3個(gè)月的大棚栽培苗、繁殖瓶苗.

3 討論與結(jié)論

3.1 栽培模式、栽培時(shí)間對(duì)金線蓮多糖含量的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在闊葉林林下栽培、繁殖瓶苗、大棚栽培3種栽培模式下，金線蓮的多糖含量以林下栽培的最高，這與吳江等[12]、黃瑞平等[13]的研究結(jié)果較為一致.但林下栽培3個(gè)月后繼續(xù)種植，其多糖含量反而減少，若需提取多糖，建議林下栽培時(shí)間可縮短為3個(gè)月.

3.2 金線蓮不同組織的多糖含量

處于蕾期、花期的金線蓮，其花蕾、花、莖、葉的多糖含量少于根部，其他時(shí)期莖、葉的多糖含量高于根部.若需提取多糖，建議避開花期，以獲得更多的多糖.

3.3 多倍體金線蓮的多糖含量

多倍體金線蓮栽培3個(gè)月的多糖含量整體上與同樣栽培3個(gè)月的寧德圓葉綠色種、漳州尖葉種相差不大，莖的多糖含量最高，達(dá)6.12%，與普通二倍體漳州尖葉種的多糖含量相比，僅為普通二倍體的0.85倍，這一結(jié)果與江金蘭等[15]對(duì)鐵皮石斛的研究結(jié)果不一致；同時(shí)，莖、根的多糖含量大于葉片，而多倍體鐵皮石斛葉片中的多糖含量最高[15].產(chǎn)生不同結(jié)果的原因可能由不同物種和培養(yǎng)時(shí)間導(dǎo)致，或受其他因素的影響.但總體來(lái)看，多倍體金線蓮的多糖含量與普通栽培品種相差不多，也就是說(shuō)，染色體倍性的增大并未增加其多糖含量，即多糖含量與染色體倍性無(wú)關(guān).因此，多倍體金線蓮要增加多糖獲得率，需要培養(yǎng)高大、強(qiáng)壯的植株，如采用金線蓮共生菌的栽培方式，可以提高植株的高度、重量及多糖含量.

3.4 水培金線蓮不同組織的多糖含量

水培3個(gè)月的金線蓮，其莖、葉的多糖含量顯著高于根部，此時(shí)莖、葉的多糖含量達(dá)到13.26%，僅次于林下栽培6個(gè)月的苗，同時(shí)顯著高于栽培3個(gè)月的大棚栽培苗、繁殖瓶苗.在提升品質(zhì)上，水培金線蓮的種植模式有利于集約化規(guī)模種植，節(jié)約能源和勞動(dòng)力，且可直接食用.