毛祥忠, 李宗波, 楊 斌, 趙 寧,

(1.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室;2.西南林業(yè)大學(xué) 云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實驗室，云南 昆明 650224)

云南是我國核桃主產(chǎn)大省，截至2017年，全省90%以上的縣種植核桃，種植面積已達(dá)288萬hm2，產(chǎn)值高達(dá)330億元[1].西藏簇角纓象天牛(Caciacretiferathibetana)隸屬于鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)纓象天牛屬(Cacia)，是危害云南核桃的主要蛀干害蟲之一.該蟲在4月底以成蟲蛀孔羽化、遷飛，5月產(chǎn)卵，6月底幼蟲開始蛀入樹干，當(dāng)年以幼蟲越冬，直至羽化為成蟲，成蟲在樹干內(nèi)生活至蛀孔遷飛[2-3].成蟲會在核桃樹皮上刻槽，槽間為1～2 cm，從下至上呈“︱”形，槽刻至核桃樹的韌皮部；幼蟲啃食的部位主要是寄主的韌皮部，之后進(jìn)入樹木的木質(zhì)部鉆蛀為害，從蟲孔排出大量糞便和木屑[4].受害的樹木因營養(yǎng)器官被破壞導(dǎo)致水分喪失，被害部位皮層開裂，甚至形成極大的樹瘤，最后樹木逐漸干枯死亡，遇風(fēng)容易折斷[5-6].

植物在正常的生理狀態(tài)下，能夠合成并釋放一系列揮發(fā)性小分子有機(jī)物，這些小分子物質(zhì)對植食性昆蟲的取食、產(chǎn)卵、求偶等行為具有調(diào)控作用[7]；同時，昆蟲通過依靠其嗅覺感器識別植物揮發(fā)性小分子物質(zhì)來篩選合適的寄主繁衍后代[8].植物受到植食性昆蟲的攻擊后，釋放的揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量會發(fā)生變化[9-10]，還會伴隨一些防御性次生代謝產(chǎn)物的釋放，其中萜烯類化合物是最豐富的一類.研究表明，蟲害誘導(dǎo)的揮發(fā)性萜類化合物的種類和相對含量都比健康植物合成的揮發(fā)性萜類多[11-13].卓志航等[14]研究表明，云斑天牛(Batoceralineolata)寄主核桃樹皮及樹葉釋放的揮發(fā)性成分中萜烯類相對含量最高；王佩星[15]研究發(fā)現(xiàn)，被光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)危害的山核桃釋放的揮發(fā)物中羅勒烯含量與健康山核桃相比顯著提高；馬艷等[16]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)桑天牛(Aprionagermari)取食和產(chǎn)卵危害后，山核桃釋放的揮發(fā)物主要是萜烯類化合物，其中(E)-β-羅勒烯和羅勒烯含量顯著上升.但是，有關(guān)西藏簇角纓象天牛取食后核桃樹皮和樹葉揮發(fā)性成分的變化尚未見報道.為此，本研究對西藏簇角纓象天牛取食前后核桃樹皮和樹葉中的揮發(fā)性成分進(jìn)行測定，以期為深入研究西藏簇角纓象天牛與寄主之間的相互作用以及研發(fā)其高效引誘劑奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

樣品于2018年5月采自云南省大理州彌渡縣核桃林.在三臺核桃(Juglanssigillata‘San-tai’)林中隨機(jī)選取3株西藏簇角纓象天牛取食過3 d的核桃樹進(jìn)行采樣，同時選取3株樹齡相同的健康核桃樹作為對照.選取距離地面2 m的核桃枝干，用剪刀剪下后采集樹皮和樹葉，置于冰盒中帶回實驗室處理.每個樣品設(shè)3個重復(fù).

1.2 核桃樹皮、樹葉揮發(fā)性物質(zhì)的提取

采用同步蒸餾萃取儀提取核桃樹皮和樹葉揮發(fā)性物質(zhì)[17].取新鮮健康的和取食后的樹皮、樹葉各100 g，剪碎后分別放到2 000 mL圓底燒瓶中，加入400 mL蒸餾水蒸餾4 h，用20 mL色譜純正己烷進(jìn)行同步萃取.然后在正己烷萃取液中加入干燥的無水硫酸鈉脫水，用N2吹掃法對萃取液進(jìn)行濃縮.

1.3 氣質(zhì)聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)測試

色譜柱：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣量2.0 μL，無分流進(jìn)樣.升溫程序：柱溫60 ℃保留2 min，以4 ℃·min-1升到100 ℃，保持5 min，以10 ℃·min-1升到260 ℃，保持5 min.電離方式為EI源，離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；接口溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍40～500 amu.

揮發(fā)物成分鑒定通過標(biāo)準(zhǔn)化合物比對以及NISTD2質(zhì)譜庫出峰時間和質(zhì)譜圖進(jìn)行匹對，通過面積歸一化法測定各種揮發(fā)性化合物的相對含量[18].

2 結(jié)果與分析

2.1 樹皮揮發(fā)性物質(zhì)主要成分及相對含量

采用GC-MS對核桃樹皮揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分離測定，從健康核桃樹皮中共鑒定出含量大于0.1%的化合物9類35種(表1)，相對含量較高的成分依次為4-烯丙基-2-甲氧基苯酚(16.70%)、1-石竹烯(8.93%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(7.36%)、β-蒎烯(6.89%).按照有機(jī)化合物的種類分析，相對含量最高的是萜烯類化合物(39.63%)，芳香族化合物(18.78%)次之.從西藏簇角纓象天牛取食過的樹皮中共鑒定出含量大于0.1%的化合物9類39種(表1)，相對含量較高的成分為4-烯丙基-2-甲氧基苯酚(16.82%)、1-石竹烯(11.49%)、β-蒎烯(11.22%)、3-(2-羥基-6-苯甲基)-4-喹唑啉酮(6.90%).按有機(jī)化合物的種類分析，相對含量最高的是萜烯類化合物，達(dá)55.50%；芳香族化合物次之，含量為17.89%.與健康核桃樹皮相比，萜烯類化合物相對含量升高了15.87%.

從表1可見，健康核桃樹皮揮發(fā)物中有8種化合物在受害樹皮中未檢測到，分別為左旋-α-蒎烯、3-甲基-3-乙基戊烷、α-古蕓烯、19-杜松醇、β-人參烯、2-氨基-6-三叔丁基-4,5,6,7-四氫化-1-苯并噻吩-3-甲酰胺、1-甲?；?2,2-二甲基-3-E-(3-甲基-丁-2-烯基)-6-甲烯基環(huán)己烷和異吲哚(1,2-b)喹啉酮；而受害樹皮揮發(fā)物中有12種化合物在健康核桃樹皮中未能檢測到，分別為(1R)-2,6,6-三甲基二環(huán)[3.3.1]庚-2-烯、雙戊烯、松油醇、氧化環(huán)己烯、a-蓽澄茄油萜、α-石竹烯、1,6-環(huán)癸二烯、二十四烷、氧化石竹烯、α-長葉蒎烯、α-桉葉油醇、十九烷.

表1 健康與受害核桃樹皮的揮發(fā)性成分比較Table 1 Comparison on the volatile components in healthy and damaged walnut bark

此外，受害樹皮揮發(fā)物中有8種化合物含量較健康樹皮明顯降低(表1)，分別為2,2-二甲基四氫呋喃、鄰甲氧基苯酚、β-蓽澄茄油烯、1-對甲苯基-2-咪唑烷酮、異丁香烯、β-桉葉醇、鄰苯二甲酸二異丁酯、二十烷；含量較健康樹皮明顯升高的有6種，分別為β-蒎烯、1-石竹烯、α-蒎烯、1,3-環(huán)癸二烯、3-(2-羥基-6-苯甲基)-4-喹唑啉酮、二十五烷.可見，西藏簇角纓象天牛取食后，核桃樹皮揮發(fā)物中含量變化最大是萜烯類化合物.

2.2 樹葉揮發(fā)性物質(zhì)主要成分及相對含量

核桃樹葉提取物的GC-MS分析結(jié)果(相對含量大于0.1%)見表2.其中，健康樹葉共鑒定出8類35種揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分為左旋-β-蒎烯(12.63%)、(1R)-2,6,6-三甲基二環(huán)[3.3.1]庚-2-烯(9.19%)、1,6-環(huán)癸二烯(7.62%)、5-丁香酸(6.16%)；相對含量最高的是萜烯類化合物，達(dá)54.77%.西藏簇角纓象天牛取食后的樹葉中共鑒定出7類35種揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分為1-石竹烯(14.35%)、β-蒎烯(12.70%)、左旋-α-蒎烯(11.64%)、1,6-環(huán)癸二烯(11.36%)、5-丁香酸(8.86%)、d-杜松烯(6.60%)、1,6,10-十二碳烯(6.45%)；相對含量最高的是萜烯類化合物，達(dá)75.74%，與健康核桃樹葉相比，萜烯類化合物相對含量升高了20.97%.

表2 健康與受害核桃樹葉的揮發(fā)性成分比較Table 2 Comparison on the volatile components in healthy and damaged walnut leaves

續(xù)表2

保留時間min登錄號化合物名稱化學(xué)式相對含量/%受害樹葉健康樹葉42.78001139-30-6氧化石竹烯C15H24O3.422.5242.85021747-46-6綠花烯C15H241.1643.54006813-21-4桉葉-3,7(11)-二烯C15H241.191.0443.73000473-15-4β-桉葉醇C15H26O1.192.5646.55000118-58-1柳酸芐酯C14H12O30.180.1450.03003422-02-4氨基甲酸C14H13NO20.1651.98000150-86-7葉綠醇C20H40O0.110.12

健康核桃樹葉揮發(fā)物中有7種化合物在受害樹葉中未檢測到，分別為2-乙基呋喃、(1R)-2,6,6-三甲基二環(huán)[3.3.1]庚-2-烯、左旋-β-蒎烯、2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯基乙醛、β-蓽澄茄油烯、(E)-β-金合歡烯、β-杜松烯；而受害樹葉中也有7種揮發(fā)性化合物在健康核桃樹葉中未能檢測到，分別為左旋-α-蒎烯、β-蒎烯、右旋萜二烯、1,6,10-十二碳烯、d-杜松烯、綠花烯、氨基甲酸.

與健康核桃樹葉相比，受害樹葉揮發(fā)物中有6種化合物含量明顯降低，分別為反式-2-己烯醛、桉葉油醇、水楊酸甲酯、α-蒎烯、(1z,4z,7z)1,5,9,9-四甲基-1,4,7-環(huán)十一三烯、β-桉葉醇；含量明顯升高的有5種，分別為α-蓽澄茄油萜、1-石竹烯、5-丁香酸、1,6-環(huán)癸二烯、氧化石竹烯.可見，西藏簇角纓象天牛取食后，核桃樹葉中揮發(fā)物相對含量變化最大的是萜烯類化合物.

3 討論

現(xiàn)有的研究表明，植食性昆蟲取食會誘導(dǎo)植物代謝的揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生變化[19-21].本研究采用同步蒸餾萃取結(jié)合GC-MS，對健康的和西藏簇角纓象天牛取食過的核桃樹皮、樹葉揮發(fā)性成分進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)核桃樹被西藏簇角纓象天牛取食后，樹皮、樹葉的揮發(fā)性成分及其相對含量均發(fā)生了變化，其中變化最大的萜烯類化合物，樹皮中含量升高了15.87%，樹葉中的含量升高了20.97%.已有研究表明，植株經(jīng)植食性昆蟲取食誘導(dǎo)釋放的萜烯類化合物種類和含量都明顯高于機(jī)械損傷或健康植株[22]，這與本研究結(jié)果一致.萜烯類化合物是蟲害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)性次生物質(zhì)的主要成分，大多數(shù)是植物受害蟲侵害后脂質(zhì)代謝的產(chǎn)物，在植物防御中起著直接和間接的作用[23-26].

西藏簇角纓象天牛的取食還誘導(dǎo)核桃樹皮、樹葉產(chǎn)生了新的揮發(fā)性化合物，如松油醇、α-桉葉油醇等;同時，受害樹皮和樹葉揮發(fā)物中部分化合物組成與健康核桃樹皮、樹葉相同，但含量發(fā)生了顯著變化，如β-桉葉醇、1-石竹烯等.這些揮發(fā)性化合物是否會影響西藏簇角纓象天牛的寄主定位和選擇行為，需要進(jìn)一步驗證.