李珩鼎，申媛媛，李曉峰，安 燕，李雪瑩，尹衍升

(上海海事大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201306)

熒光探針作為一種檢測(cè)手段，具有靈敏度高、選擇性好、使用方便、信號(hào)易于觀察和獲取、便于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[1-3]，被廣泛應(yīng)用于化學(xué)分析、環(huán)境檢測(cè)、生物醫(yī)療和工業(yè)探傷等領(lǐng)域[4-5].近年來，針對(duì)不同金屬離子的熒光探針獲得了很大發(fā)展，如Ag+、Cu2+、Hg2+、Al3+等[6-9].Fe3+在生命活動(dòng)和金屬腐蝕領(lǐng)域具有重要作用[10]，針對(duì)Fe3+的熒光探針具有重要的實(shí)際使用意義.邊延江等[11]利用1-萘甲醛和2-氨基苯硫酚合成了一種Fe3+熒光探針，該探針可在純二甲基亞砜中利用熒光淬滅現(xiàn)象檢測(cè)出Fe3+.張媛等[12]基于羅丹明類染料制備了一種“開-關(guān)”型Fe3+熒光探針，這種探針可通過熒光強(qiáng)度和溶液顏色雙信號(hào)檢測(cè)出Fe3+，同時(shí)該探針具有良好的生物相容性，可用于生物體內(nèi)的熒光成像.但是這些Fe3+熒光探針都需要在紫外或可見光的激發(fā)下工作，而探針檢測(cè)的準(zhǔn)確性常常受到光源和環(huán)境穩(wěn)定性的影響.

長(zhǎng)余輝發(fā)光材料可在光源停止激發(fā)后，利用自身存儲(chǔ)的能量繼續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)光[13].SrAl2O4∶Eu2+,Dy3+是常見的長(zhǎng)余輝發(fā)光材料，其在自然光照射下即可發(fā)出綠色磷光，并且經(jīng)過激發(fā)后可保持20 h以上的余輝.此外，SrAl2O4∶Eu2+,Dy3+的發(fā)射峰位于510 nm處，與羅丹明B的吸收峰有較好的重疊，這使兩者間可能形成熒光共振能量轉(zhuǎn)移[14].將長(zhǎng)余輝材料作為內(nèi)部光源應(yīng)用于熒光探針，使探針不僅具有傳統(tǒng)熒光探針在光源激發(fā)下的檢測(cè)性能，而且具備在無光源激發(fā)條件下，利用探針余輝實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的，從而避免光源對(duì)探針檢測(cè)結(jié)果的影響和提高探針使用的便捷性.

本文在SrAl2O4∶Eu2+,Dy3+顆粒表面包覆一層SiO2保護(hù)層[15]，通過硅烷偶聯(lián)劑將其與羅丹明B連接構(gòu)成一種新型熒光探針.采用掃描電鏡觀察其微觀形貌，利用熒光光譜儀表征探針的光學(xué)性能，并研究了酸化處理對(duì)探針性能的影響以及探針在不同條件下的檢測(cè)性能.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 SrAl2O4∶Eu2+,Dy3+的包覆改性

首先按體積比1∶4量取適量的TEOS和無水乙醇，并混合于一個(gè)燒杯內(nèi).然后用稀硝酸調(diào)節(jié)該混合液的pH值到1左右.將調(diào)節(jié)pH值后的混合溶液在水浴60 ℃的條件下加熱1 h.按包覆比0.3稱取適量的SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+粉末.包覆比為TEOS中的SiO2含量與SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+粉末的質(zhì)量比.在磁力攪拌并且水浴60 ℃加熱的條件下，將稱量好的SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+粉末加入到上述調(diào)節(jié)pH值后的混合溶液中，然后將適量去離子水加入反應(yīng)體系中.保持磁力攪拌和水浴加熱條件不變直到燒杯內(nèi)形成凝膠.將形成凝膠后的燒杯靜置陳化后置于電鼓風(fēng)烘箱內(nèi)，于60 ℃的條件下烘干.待樣品烘干后，將所得樣品在馬弗爐中加熱到300 ℃，保溫2 h后取出并在空氣中冷卻.待樣品冷卻至室溫后，將其研磨至粉末獲得包覆SiO2的SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+粉末樣品.

1.2 探針的制備

稱取制備SiO2包覆SrAl2O4∶Eu2+,Dy3+樣品，并將其分散于無水乙醇中.向上述溶液中滴加2 mL的硝酸.0.5 h后將含酸溶液離心分離出樣品，并用無水乙醇溶液洗滌2次，獲得酸化的SiO2包覆SrAl2O4∶Eu2+,Dy3+樣品.將所獲得的樣品分散于乙醇和去離子水的混合溶液中(乙醇和去離子水體積比1∶1).在磁力攪拌的條件下，向上述溶液中逐滴滴加硅烷偶聯(lián)劑.接著將有機(jī)染料加入到此溶液中.在磁力攪拌的條件下反應(yīng)0.5 h.反應(yīng)結(jié)束后，離心獲得樣品，并用無水乙醇和去離子水分別洗滌2次.將離心產(chǎn)物放置于電鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，在80 ℃的條件下烘干，獲得粉末狀的熒光探針樣品并收集備用.

1.3 樣品的表征

采用日本電子株式會(huì)社的JSF 7 500F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)探針的形貌進(jìn)行觀察，并用電鏡配套的能譜對(duì)探針元素進(jìn)行分析.采用英國(guó)愛丁堡儀器公司的FLS920型熒光光譜儀測(cè)定探針的熒光光譜，測(cè)試時(shí)采用360 nm的光源激發(fā)樣品.

2 結(jié)果與討論

2.1 探針的表征

如圖1(a)所示，包覆SiO2的SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+連接羅丹明B構(gòu)成的探針粒徑在幾微米～幾十微米.大部分顆粒的粒徑在十幾微米，有少部分幾微米的顆粒和極少數(shù)大于20微米的顆粒.說明制備的探針粒徑分布較為均勻，尺寸較小.圖1(b)為圖1(a)中某顆粒的電鏡照片.該探針顆粒的粒徑在10 μm左右，呈不規(guī)則的形狀.其表面粗糙，表面分布著不規(guī)則的孔洞結(jié)構(gòu).對(duì)其部分表面進(jìn)行能譜測(cè)試，測(cè)試結(jié)果如圖1(c)所示.結(jié)果表明，該探針顆粒的表面成分除了SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+所含有的Sr、Al、O、Si以外，還含有少量的C元素和N元素存在，這說明羅丹明B通過硅烷偶聯(lián)劑連接在SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+的表面上.

2.2 酸化處理的影響

圖2 是SiO2包覆的SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+酸化前后分別與羅丹明B連接的發(fā)射光譜.從圖中可見，未經(jīng)酸化處理的SrAl2O4∶Eu2+,Dy3+與羅丹明B連接后，屬于SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+的發(fā)射峰略有藍(lán)移.同時(shí)，樣品在560 nm～650 nm內(nèi)發(fā)射峰的形狀與SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+相同范圍內(nèi)的不同. 說明SrAl2O4∶Eu2+,

Dy3+和羅丹明B之間存在微弱的熒光共振能量轉(zhuǎn)移.而經(jīng)過酸化處理后，SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+與羅丹明B連接后的發(fā)射光譜存在兩個(gè)明顯的峰.這說明酸化處理很大程度上提高了SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+與羅丹明B連接的能力.酸化處理增加了SiO2包覆層表面的活性羥基數(shù)量，使更多的羅丹明B能夠與SrAl2O4∶Eu2+,Dy3+相連接，增加了熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率.

圖1 探針的電鏡照片(a)(b)及能譜數(shù)據(jù)(c)

Fig.1 SEM images of the fluorescent probe (a),(b), and its EDS data (c)

圖2 SiO2包覆的SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+酸化前后分別與羅丹明B連接的發(fā)射光譜

Fig.2 Fluorescence emission spectra of SrAl2O4∶Eu2+,Dy3+connecting rhodamine B before and after acidification

2.3 探針對(duì)不同金屬離子的響應(yīng)

將SiO2包覆的SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+連接羅丹明B構(gòu)成的探針稀釋于乙醇溶液中后，向溶液中滴加不同種類的金屬離子(金屬離子的濃度均為1 mmol/L)并分別測(cè)得其發(fā)射光譜.從圖3中可以看到，滴加金屬離子前的探針，具有2個(gè)明顯的發(fā)射峰.2個(gè)發(fā)射峰的位置分別位于510和564 nm處，并且564 nm處的發(fā)射峰的強(qiáng)度比510 nm處的發(fā)射峰要略高一些.當(dāng)含有Ni+的溶液被滴加到含有探針的乙醇溶液中后，探針的2個(gè)發(fā)射峰的強(qiáng)度發(fā)生變化，564 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度變得比510 nm處發(fā)射峰低一些，但2個(gè)峰在發(fā)射光譜中均較明顯.與Ni+類似，向含有探針的乙醇溶液中滴加Fe2+后，564 nm處的發(fā)射峰也會(huì)有所降低但該處的發(fā)射峰仍較為明顯.向含有探針的乙醇溶液中滴加Al3+后，564 nm處的發(fā)射峰降低程度較大但該處的發(fā)射峰仍較為明顯.滴加Zn2+后的探針的發(fā)射光譜與未滴加金屬離子的探針的光譜類似，兩處發(fā)射峰的強(qiáng)度較為接近，基本相同.滴加Cu2+后的探針的發(fā)射光譜中的2個(gè)發(fā)射峰中，564 nm處的發(fā)射峰也會(huì)略有所降低.與滴加其他金屬離子不同的是，F(xiàn)e3+在滴加到含探針的乙醇溶液中后，探針的發(fā)射光譜在564 nm處發(fā)射峰強(qiáng)度有著顯著地降低，并且遠(yuǎn)低于510 nm處發(fā)射峰的強(qiáng)度.

圖3 羅丹明B型探針滴加不同種類的金屬離子的熒光發(fā)射光譜

Fig.3 Fluorescence emission spectra of the probe with different kinds of metal ion

這說明SrAl2O4∶Eu2+,Dy3+連接羅丹明B構(gòu)成的探針對(duì)Fe3+具有很好的識(shí)別作用.并且與其他金屬離子相比，探針對(duì)Fe3+的響應(yīng)有著特殊的信號(hào)，即564 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度會(huì)有明顯降低.這使得該探針能夠檢測(cè)溶液中的Fe3+.

從圖4可以看出，多種金屬離子都會(huì)導(dǎo)致F564 nm/F510 nm的比值降低.未滴加任何金屬離子前，該比值為1.046，兩個(gè)發(fā)射峰的強(qiáng)度大抵相同.Zn2+對(duì)該比值的影響最小，僅下降了13%.而Cu2+和Ni+對(duì)該比值的影響稍大一些，該比值分別下降了19%和21%.Al3+會(huì)使得該比值下降25.4%，F(xiàn)e2+會(huì)使得該比值下降28.8%，其影響比Cu2+和Ni+都大一些.但是，這幾種常見的金屬離子導(dǎo)致的該比值下降程度均不超過30%.而Fe3+滴加后，該比值大幅下降，僅為0.607，說明此時(shí)SiO2包覆的SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+和羅丹明B之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移受到很大的阻礙.與滴加前相比，該比值下降達(dá)到42%，超過上述其他金屬離子.因此，SiO2包覆的SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+連接羅丹明B構(gòu)成的探針對(duì)Fe3+有著很好的識(shí)別與檢測(cè)作用，但在使用過程中應(yīng)避免其他金屬離子的干擾.

圖4 滴加不同金屬離子后含羅丹明B探針的乙醇溶液的發(fā)射光譜的2個(gè)發(fā)射峰比值

Fig.4 Ratios of two emission peaks of the probe with different kinds of metal ions

2.4 探針對(duì)不同濃度Fe3+的檢測(cè)

為了研究SiO2包覆的SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+連接羅丹明B構(gòu)成的探針對(duì)Fe3+的檢測(cè)范圍，含不同濃度Fe3+的溶液被滴加到含探針的乙醇溶液中.從圖5可以看到，未滴加鐵離子溶液時(shí)的探針有2個(gè)明顯的發(fā)射峰，分別位于510和564 nm處，且564 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度比510 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度略高.向該溶液中滴加濃度100 μmol/L的三價(jià)鐵離子溶液后，發(fā)射光譜仍然有2個(gè)明顯的發(fā)射峰，并且發(fā)射峰的位置沒有明顯變化.不同的是，564 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度于比未滴加鐵離子前相比略有下降，并且此時(shí)564 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度低于510 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度.隨著向含探針的乙醇溶液中滴加鐵離子溶液濃度的升高，510 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度會(huì)略有降低，而564 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度會(huì)大幅降低，并在鐵離子濃度達(dá)到1 mmol/L時(shí)下降到?jīng)]有明顯的發(fā)射峰出現(xiàn).

圖5 滴加不同濃度的三價(jià)鐵離子溶液后的含探針的乙醇溶液的發(fā)射光譜

Fig.5 Fluorescence emission spectra of probe with different concentrations of Fe3+

從圖6(a)可以看到，隨著滴加的Fe3+濃度的增加，兩個(gè)發(fā)射峰強(qiáng)度的比值F564 nm/F510 nm逐步降低.圖6(a)中隨著滴加的鐵離子濃度從0～500 μmol/L的變化，2個(gè)發(fā)射峰強(qiáng)度的比值F564 nm/F510 nm的降低幅度大致相同，而鐵離子濃度從500 μmol/L變化到600 μmol/L時(shí)，F(xiàn)564 nm/F510 nm的降低幅度明顯變小.當(dāng)鐵離子濃度從600 μmol/L變化到1 mmol/L時(shí)，該比值的下降很少，1 mmol/L處的比值幾乎與600 μmol/L處的比值持平.并且從6(b)可以看到，滴加的鐵離子濃度從0～500 μmol/L時(shí)存在著線性關(guān)系；而當(dāng)?shù)渭拥蔫F離子濃度增加到600 μmol/L后，該線性關(guān)系將不存在.因此，該探針可以利用此線性關(guān)系，定量地檢測(cè)出溶液中100～500 μmol/L范圍內(nèi)的Fe3+的濃度.

2.5 利用探針余輝檢測(cè)Fe3+

將制備的SiO2包覆的SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+連接羅丹明B構(gòu)成的探針分散在無水乙醇溶液中，并在360 nm光源的激發(fā)下測(cè)得其發(fā)射光譜.然后停止光源的激發(fā)，從停止激發(fā)的一刻起計(jì)時(shí)，分別測(cè)得停止激發(fā)后1、2和3 min的發(fā)射光譜.從圖7可以看到，探針分散于無水乙醇溶液中后，在光源的激發(fā)下，其發(fā)射光譜有2個(gè)明顯的發(fā)射峰，分別位于510和564 nm處.當(dāng)停止光源的激發(fā)后，測(cè)得探針的發(fā)射光譜仍然具有兩個(gè)明顯的發(fā)射峰. 并且兩個(gè)發(fā)射峰都沒有發(fā)生藍(lán)移或者紅移. 但是停止光源的激發(fā)1 min后，探針發(fā)射光譜中的2個(gè)發(fā)射峰發(fā)光強(qiáng)度明顯低于在光源激發(fā)的狀態(tài)下測(cè)得的發(fā)射光譜中2個(gè)發(fā)射峰，發(fā)光強(qiáng)度僅為后者的1/10左右.這說明探針在光源停止激發(fā)后的余輝強(qiáng)度比探針在光源激發(fā)條件下的發(fā)光強(qiáng)度大幅下降.停止光源激發(fā)后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，探針的發(fā)射光譜沒有因?yàn)闀r(shí)間的變化而發(fā)生發(fā)射峰位置的變化，但發(fā)光強(qiáng)度不斷降低.同時(shí)，探針在光源激發(fā)下和停止光源激發(fā)后的不同時(shí)間測(cè)得的發(fā)射光譜2個(gè)發(fā)射峰的強(qiáng)度比值F564 nm/F510 nm都在0.85左右，這說明探針分散于無水乙醇溶液中后，停止光源的激發(fā)對(duì)2個(gè)發(fā)射峰發(fā)光強(qiáng)度的比值影響不大.

圖6 探針兩個(gè)發(fā)射峰強(qiáng)度比值與滴加的Fe3+濃度關(guān)系

Fig.6 Relationship between ratios of two emission peaks of probe and concentrations of Fe3+:(a) Ratios of two emission peaks of probe with different concentrations of Fe3+;(b) Fitting linear relation of ratios of two emission peaks of probe

圖7 探針分散于無水乙醇溶液中在光源激發(fā)下及停止激發(fā)后不同時(shí)間的發(fā)射光譜

Fig.7 Fluorescence emission spectra of probe dispersed in ethyl alcohol with and without exciting light

在停止光源的激發(fā)3 min后，測(cè)得探針余輝的發(fā)射光譜，然后向溶液中分別滴加濃度為500 μmol/L和1 mmol/L的Fe3+溶液并測(cè)得其發(fā)射光譜.如圖8所示，滴加Fe3+前，探針的余輝的發(fā)射光譜具有2個(gè)明顯的發(fā)射峰，分別位于510和564 nm處.而向溶液中滴加濃度為500 μmol/L Fe3+后，探針余輝的發(fā)射光譜與滴加Fe3+前相比明顯不同，位于510 nm的發(fā)射峰強(qiáng)度略有減弱，而位于564 nm處的發(fā)射峰降低幅度較大，但發(fā)射峰仍較明顯.探針余輝在滴加濃度為1 mmol/L Fe3+后，原本位于564 nm處的發(fā)射峰消失.這說明該探針能夠利用其余輝定性的檢測(cè)溶液中500 μmol/L以上濃度的Fe3+.

圖8 探針分散于無水乙醇溶液滴加鐵離子前后的余輝的發(fā)射光譜

Fig.8 Fluorescence emission spectra of probe without exciting light before and after injected Fe3+

圖9為探針的結(jié)構(gòu)及其檢測(cè)機(jī)理示意圖.一層SiO2包覆在SrAl2O4∶Eu2+,Dy3+表面，羅丹明B通過硅烷偶聯(lián)劑連接在SiO2包覆的SrAl2O4∶Eu2+,Dy3+上.在光源激發(fā)下，由于FRET效應(yīng)，SrAl2O4∶Eu2+,Dy3+獲得能量并傳遞給羅丹明B.停止光源的激發(fā)后，SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+利用存儲(chǔ)的能量繼續(xù)發(fā)光，并將部分存儲(chǔ)的能量傳遞給羅丹明B.當(dāng)羅丹明B與Fe3+接觸后，羅丹明B的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，與SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+間的FRET被破壞，羅丹明B不再獲得能量發(fā)光，從而達(dá)到檢測(cè)溶液中Fe3+的目的.

圖9 探針的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理示意圖

Fig.9 Schematic diagram of the structure and mechanism of the probe

3 結(jié) 論

(1)羅丹明B能夠與SiO2包覆的SrAl2O4∶Eu2+,Dy3+連接并構(gòu)成基于能量共振轉(zhuǎn)移的熒光探針.對(duì)進(jìn)行酸化處理能夠顯著提高羅丹明B連接SiO2包覆的SrAl2O4∶Eu2+, Dy3+效果.

(2)多種金屬離子都會(huì)導(dǎo)致探針的2個(gè)發(fā)射峰的強(qiáng)度比值F564 nm/F510 nm降低，其中Fe3+引起的降低幅度遠(yuǎn)大于其他金屬離子.

(3)該探針可以通過發(fā)射光譜中2個(gè)發(fā)射峰強(qiáng)度比值F564 nm/F510 nm的變化對(duì)100～500 μmol/L濃度范圍內(nèi)的Fe3+進(jìn)行定量檢測(cè)，對(duì)500 μmol/L以上濃度的Fe3+只能進(jìn)行定性檢測(cè).探針余輝性能良好，利用探針的余輝可以定性地檢測(cè)出溶液中500 μmol/L以上濃度的Fe3+.