胡曉，李濟彤，常靜，郭寶元，王會利,*

1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

三唑類殺菌劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和人類真菌病防治領(lǐng)域，它們主要通過抑制羊毛甾醇-14-去甲基化酶(CYP51)來阻礙真菌細(xì)胞壁的生成，進而產(chǎn)生抑菌效果[1]。三唑類殺菌劑是世界上使用量最多，應(yīng)用最廣泛的殺菌劑之一，然而經(jīng)過農(nóng)藥噴灑、雨水沖刷和植物根系轉(zhuǎn)移等作用后，三唑類殺菌劑會進入水、土壤和農(nóng)作物等多種環(huán)境介質(zhì)中，對環(huán)境中的大量非靶標(biāo)生物造成威脅[2]。

許多三唑類殺菌劑屬于手性農(nóng)藥，它們通常含有一個或多個手性中心，從而擁有多個對映體。在非手性環(huán)境中，手性農(nóng)藥的不同對映體具有相同的物理和化學(xué)性質(zhì)，然而，在生物體內(nèi)，不同對映體的生物活性往往具有很大差異，導(dǎo)致不同對映體在生物體內(nèi)的代謝、分布和毒性表現(xiàn)出對映選擇性[3-4]。三唑醇(triadimenol, TN)是一種典型的手性三唑類殺菌劑，它含有2個手性中心，包括2對異構(gòu)體，對映體A和對映體B，其中，對映體A包括A1(R,S)和A2(S,R)，對映體B包括B1(R,R)和B2(S,S)。研究發(fā)現(xiàn)，三唑醇是一種潛在的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，它能夠干擾多種生物體性腺系統(tǒng)的穩(wěn)定。例如，三唑醇暴露后的斑馬魚體內(nèi)性激素水平失衡，子代數(shù)量顯著減少，三唑醇表現(xiàn)出明顯的生殖毒性[5]。此外，體內(nèi)和體外實驗結(jié)果均表明，三唑醇能夠抑制人體內(nèi)芳香化酶(CYP19)的活性，由于芳香化酶主要負(fù)責(zé)雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，因此，三唑醇暴露會導(dǎo)致體內(nèi)雌激素水平出現(xiàn)異常[6-7]。目前，關(guān)于三唑醇對性腺系統(tǒng)的影響主要針對外消旋體，缺乏對映體層面的研究。然而，已有的研究表明，三唑醇的4種對映體在土壤、作物、微生物和魚中的吸收、轉(zhuǎn)化和降解具有明顯的對映選擇性，并且A2對映體的殺菌活性是其他對映體的1 000倍以上，說明三唑醇對映體在生物體內(nèi)的活性具有明顯差異[8-9]。因此，有必要從對映體層面研究三唑醇對性腺系統(tǒng)的干擾效應(yīng)，考察其外消旋體與不同對映體之間的差異。

近年來，爬行動物的數(shù)量在全世界范圍內(nèi)出現(xiàn)了下降，其原因主要包括全球氣候變化、棲息地減少和環(huán)境污染等[10]。農(nóng)藥作為陸地生態(tài)系統(tǒng)中使用量最大、使用時間最長的化學(xué)品，被認(rèn)為是導(dǎo)致爬行動物數(shù)量下降的一個重要原因[11]。目前，針對爬行動物的毒理學(xué)研究仍然較少，在大部分風(fēng)險評估中往往由鳥類數(shù)據(jù)代替。蜥蜴是爬行動物中種群數(shù)量最大的物種，占據(jù)了爬行動物種群數(shù)量的60%，它們終生生活在陸地環(huán)境中，棲息地廣泛，暴露于環(huán)境污染物的可能性很高，被認(rèn)為是評價環(huán)境污染物的良好模型[12-13]。麗斑麻蜥是中國的本土物種，主要分布于揚子江北部地區(qū)。由于其體型小，在實驗室中易于飼養(yǎng)，在許多研究中已經(jīng)被選為實驗動物來進行爬行動物的生態(tài)毒理學(xué)研究[14-15]。

為了探究三唑醇及其對映體對麗斑麻蜥性腺系統(tǒng)的影響，本研究中將成年雄性麗斑麻蜥分別暴露于三唑醇外消旋體和4種對映體。暴露28 d后測定了性腺中雌雄激素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平和血液中雌雄激素的含量，并記錄了實驗過程中蜥蜴體重的變化和性腺體細(xì)胞指數(shù)，從對映體層面揭示了三唑醇對蜥蜴性腺系統(tǒng)的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，為評價手性三唑類殺菌劑對爬行動物的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 化學(xué)品與試劑

三唑醇外消旋體(純度>98.9%)購自Dr. Ehrenstorfer公司(奧格斯堡，德國)，三唑醇外消旋體及4種對映體保存在甲醇(分析純)中，4 ℃避光儲存。所有的化學(xué)試劑，包括甲醇、乙醇、異丙醇、三氯甲烷和正己烷(分析純)，購自迪瑪科技有限公司(北京)。

1.2 三唑醇對映體的分離和制備

采用菲羅門Lux Cellulose-1手性柱(250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm)在安捷倫1260高效液相色譜上(HPLC)分離三唑醇對映體。紫外檢測波長為225 nm，流動相組成為甲醇和水(70∶30，V/V)，進樣量為20 μL，流速為1.5 mL·min-1，根據(jù)紫外信號手動收集4種對映體。依據(jù)已有的研究，4種對映體的流出順序為A2、A1、B2和B1[16]。經(jīng)檢驗，分離后4種對映體的純度均大于96%。將分離后的4種對映體保存在甲醇中，4 ℃避光保存。

1.3 麗斑麻蜥的飼養(yǎng)

實驗室蜥蜴生活在5 m×1.2 m×0.4 m的玻璃培養(yǎng)箱中，底部覆有10 cm厚的細(xì)沙土。每個玻璃培養(yǎng)箱配有6個紫外燈，玻璃箱的溫度控制在25～30 ℃，濕度控制在30%～40%。蜥蜴每天喂食活的黃粉蟲(Tenebriomolitor)，每2天灑一次水，清理玻璃箱中的排泄物。選擇健康、性成熟的成年(3～4 g，2～3歲)雄性麗斑麻蜥，實驗開始前將所選蜥蜴轉(zhuǎn)移至50 cm×50 cm×40 cm的塑料培養(yǎng)箱中，在相同條件下培養(yǎng)適應(yīng)2周。

1.4 暴露實驗

目前缺乏三唑醇對爬行動物的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，而鳥類一般作為爬行動物風(fēng)險評估的替代物種，Hao等[17]在腈菌唑的毒性研究中認(rèn)為，鳥類LD50的5%可作為慢性暴露濃度，也是麗斑麻蜥的敏感濃度，能夠引起其明顯的生理反應(yīng)。此外，Wang等[18]通過亞慢性暴露實驗(14 d)得出三唑酮對麗斑麻蜥的最高非致死劑量為200 mg·kg-1bw；Li等[19]將麗斑麻蜥暴露于100 mg·kg-1bw三唑酮21 d，未發(fā)現(xiàn)麗斑麻蜥出現(xiàn)明顯的致病和致死效應(yīng)。由于三唑醇是三唑酮在生物體內(nèi)的代謝物，其毒性與三唑酮相近，因此，選擇三唑醇對鳥類LD50的5%，即100 mg·kg-1bw作為三唑醇暴露濃度。

將所有蜥蜴(18只)隨機分為6個組(每組3只)，包括一個對照組和5個暴露組。5個暴露組中，蜥蜴每天分別經(jīng)口暴露100 mg·kg-1bw外消旋體和4種對映體。暴露28 d后將蜥蜴于二氧化碳培養(yǎng)箱中安樂死，立即從頸部收集蜥蜴的血液，迅速離心(1 000 g、5 min、4 ℃)后取上清液，于-80 ℃避光保存。提取實驗蜥蜴的睪丸，用生理鹽水沖洗干凈后擦干，稱重后凍存于-80 ℃冰箱。

1.5 總RNA提取和cDNA合成

使用TRNzol A+試劑(北京天根生化科技有限公司)遵照操作規(guī)程提取性腺組織中的總RNA，利用Nano-drop-2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific, USA)測定所得RNA的濃度和純度。使用Fastking RT試劑盒(含gDNase)(北京天根生化科技有限公司)，對2 μg RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μL。首先將RNA在冰上解凍，依次加入5g DNA buffer(2 μL)、FQ-RT Primer Mix(2 μL)、FastKing RT Enzyme Mix(1 μL)，加入RNase-Free ddH2O(5 μL)得到10 μL的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系混合液，然后將混合液加入到gDNA去除反應(yīng)體系(10 μL)中，充分混勻。依次在42 ℃條件下孵育15 min，95 ℃條件下孵育3 min，得到的cDNA保存在-20 ℃冰箱中。

1.6 實時定量PCR

使用Talent qPCR PreMix(SYBR Green)(北京天根生化科技有限公司)試劑盒和MX3005P型熒光定量PCR儀(Stratagene, USA)對性腺中性激素合成相關(guān)基因進行實時定量PCR，相關(guān)基因的引物序列均來源于美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫。采用兩步法PCR反應(yīng)程序進行反應(yīng)，首先在95 ℃下預(yù)變性3 min，PCR反應(yīng)階段首先在95 ℃、5 s條件下變性，最后于60 ℃、15 s條件下退火和延伸，反應(yīng)經(jīng)歷40個循環(huán)后終止。對每個基因的擴增進行熔解曲線分析，保證基因的特異性擴增(熔解曲線僅出現(xiàn)單一峰)。

1.7 性激素含量和性腺體細(xì)胞指數(shù)測定

將離心后的血清在常溫下解凍后攪拌混勻，使用酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)測定血清中的雌二醇(E2)和睪酮(T)含量。試劑盒測定雌二醇和睪酮的靈敏度分別為25 pg·mL-1和0.1 ng·mL-1，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于15%。

蜥蜴性腺體細(xì)胞指數(shù)(GSI)的計算公式為：GSI(%)=性腺重量(g)/蜥蜴體重(g)×100%

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Origin Pro 9.1軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用獨立樣本T檢驗(Independent T-test)方法分析暴露組和對照組之間的差異，*P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 蜥蜴體重及性腺體細(xì)胞指數(shù)

對照組和暴露組的體重變化和28 d時性腺體細(xì)胞指數(shù)(GSI)如表1所示。所有蜥蜴的體重均維持在3～4 g之間，暴露期間無個體死亡，每個組的體重都沒有出現(xiàn)明顯變化。與對照組相比，外消旋體和A1暴露組的GSI明顯降低，而A2、B1和B2暴露組的GSI相比于對照組無明顯差異。

2.2 性激素合成相關(guān)基因的表達

三唑醇外消旋體和4種對映體暴露28 d后，通過實時定量PCR測定了麗斑麻蜥性腺中性激素合成相關(guān)基因的相對mRNA表達量(圖1)。對映體A1和A2暴露后，性腺中cyp19a、cyp17、cyp11a和hsd-17β的表達都受到明顯抑制(0.25～0.64倍)。A1暴露組中hsd-3β基因的表達量也明顯降低(0.55倍)，而A2暴露組中hsd-3β的表達量無明顯變化。B1對映體暴露后，cyp19a和hsd-3β的表達量顯著上升(分別為1.7倍和3.1倍)，而cyp17、cyp11a和hsd-17β的表達沒有明顯變化。B2對映體能夠顯著抑制cyp19a、cyp11和hsd-17β的表達(0.52～0.77倍)，同時會導(dǎo)致hsd-3β基因的表達量增加(3.5倍)。外消旋體對cyp19a、cyp17、cyp11a、hsd-3β和hsd-17β基因都有不同程度的抑制作用(0.17倍～0.78倍)。此外，外消旋體和對映體A1、A2和B2都抑制了性腺中erα基因的表達，對映體A1、A2和B2還抑制了ar基因的表達，而B1暴露后性腺中的erα和ar基因表達都沒有顯著變化。通過外消旋體與4種對映體對性腺系統(tǒng)基因表達譜的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，外消旋體對性腺系統(tǒng)相關(guān)基因的影響僅與A1具有較強的相關(guān)性(P<0.05)(表2)。

表1 三唑醇28 d暴露期間麗斑麻蜥體重變化及性腺體細(xì)胞指數(shù)(GSI)Table 1 The change of body weight and gonad somatic index (GSI) of Eremias argus during the 28 d exposure to triadimenol racemate and its four enantiomers

注：A1、A2、B1和B2分別表示(R,S)、(S,R)、(R,R)和(S,S)；數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示(n=3)，*表示與對照組具有顯著性差異(P<0.05)。

Note: A1, A2, B1 and B2 represent (R,S), (S,R), (R,R) and (S,S) respectively; the data was expressed as mean±S.D. (n=3); *indicates significant difference compared with the control (P<0.05).

表2 外消旋體與4種對映體對性腺中激素合成相關(guān)基因表達量的相關(guān)性分析Table 2 The correlation analysis of steroidogenic-related gene expression profile between racemate and each enantiomer

2.3 血液中性激素水平

三唑醇外消旋體和4種對映體暴露28 d后，對照組和暴露組麗斑麻蜥血液中的雌雄激素含量如圖2所示。與對照組相比，A1、A2和B2暴露后血液中雌雄激素水平都出現(xiàn)明顯下降，但是相比于A1和A2，B2暴露對雌雄激素水平的影響更小。B1對映體暴露后蜥蜴體內(nèi)雌雄激素的含量都沒有出現(xiàn)顯著變化。外消旋體暴露后，蜥蜴體內(nèi)雄激素的含量出現(xiàn)明顯下降而雌激素水平?jīng)]有變化。

3 討論(Discussion)

體重和組織體細(xì)胞指數(shù)(TSI)是從個體和組織水平預(yù)測機體毒性的有效指標(biāo)[20]。三唑醇外消旋體和4種對映體(100 mg·kg-1bw)暴露后，各個組中蜥蜴的體重都沒有出現(xiàn)顯著變化，說明在本實驗條件下三唑醇對麗斑麻蜥的生長沒有造成明顯的影響。外消旋體和A1對映體暴露后，蜥蜴性腺體細(xì)胞指數(shù)(GSI)明顯低于對照組，而A2、B1和B2暴露后的GSI沒有顯著變化，說明外消旋體和A1對性腺組織的毒性可能高于其他對映體。

圖1 三唑醇外消旋體及對映體(100 mg·kg-1 bw)分別暴露28 d后麗斑麻蜥性腺中激素合成相關(guān)基因的相對mRNA表達量注：*表示與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 1 Relative mRNA expression of steroidogenic-related genes in gonads after exposure to the racemate and its four enantiomers (100 mg·kg-1 bw) for 28 d in male lizardsNote: *indicates significant difference compared with the control (P<0.05).

一般來說，干擾性腺中性激素合成相關(guān)酶的活性或者競爭性結(jié)合體內(nèi)雌雄激素受體是外源性物質(zhì)干擾性腺系統(tǒng)穩(wěn)定的最主要的2種方式[21-22]。性腺中性激素合成路線如圖3所示，CYP11A酶首先將膽固醇(cholesterol)轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮(pregnenolone)，這是體內(nèi)所有固醇類激素合成的第一步和限速步驟[23]。隨后在HSD-3β和CYP17的催化下孕烯醇酮被轉(zhuǎn)化為雄烯二酮[24]。沒有活性的類固醇經(jīng)HSD-17β羥基化后被激活，CYP19A酶催化性腺中的T轉(zhuǎn)化為E2[25-26]。雌激素受體(ER-α)和雄激素受體(AR)都屬于配體激活型核受體超家族，它們與雌/雄激素結(jié)合后進入細(xì)胞核，與目標(biāo)基因的雌/雄激素響應(yīng)元件(ERE/ARE)結(jié)合，調(diào)節(jié)它們的轉(zhuǎn)錄和表達。雌/雄受體介導(dǎo)的信號通路對性腺系統(tǒng)的生長和功能具有重要作用[27]。本實驗中，A1和A2對映體暴露后，性腺中性激素合成基因(cyp11a、cyp17、cyp19a、hsd-3β和hsd-17β)的表達量都出現(xiàn)顯著下降，性腺中雌雄激素的響應(yīng)(erα和ar)明顯降低，同時蜥蜴血液中的睪酮(T)和雌二醇(E2)水平也顯著低于對照組，這說明A1和A2對映體能夠阻礙蜥蜴體內(nèi)性激素的合成。B2對映體同樣能夠抑制性腺中主要的性激素合成基因(cyp11、cyp19a和hsd-17β)的表達，并且血液中雌雄激素含量也明顯低于對照組。但是與A1和A2暴露組相比，B2對蜥蜴性激素合成相關(guān)基因的抑制作用更弱，對性腺系統(tǒng)的毒性更低。T和E2是生物體內(nèi)固醇激素的主要存在形式，它們主要由性腺中的間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，并通過血液循環(huán)運送至各個組織器官。研究表明，T和E2不僅影響性腺組織的發(fā)育和功能，還對肝、心臟、肌肉和大腦等具有重要的調(diào)節(jié)作用[24]。因此，血液中T和E2的含量通常被作為衡量性腺系統(tǒng)穩(wěn)定的重要指標(biāo)。有報道指出，三唑類物質(zhì)(l,l-di(4-fluorophenyl)-2-(1,2,4-triazol-1-yl)-ethanol)染毒小鼠后，小鼠體內(nèi)的固醇類激素合成酶被抑制，E2水平下降，小鼠出現(xiàn)性腺發(fā)育遲緩癥狀[28]。此外，丙環(huán)唑(propiconazole)暴露后的成年黑頭呆魚體內(nèi)cyp19a、cyp11和cyp17的表達量也明顯下降，并出現(xiàn)產(chǎn)卵量減少、性腺重量增加等現(xiàn)象[29]。因此，本實驗中三唑醇A1、A2和B2對映體對蜥蜴性腺的影響也可能會導(dǎo)致機體出現(xiàn)生殖和發(fā)育毒性，但是由于實驗周期較短(28 d)，實驗過程中沒有觀察到蜥蜴出現(xiàn)明顯的生理學(xué)異常。B1對映體暴露后，性腺中hsd-3β和cyp19a的表達量顯著增加，這種變化會增加雄激素的合成以及雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，這可能是導(dǎo)致性腺中雌激素響應(yīng)(erα)上升的原因。但B1暴露后蜥蜴體內(nèi)的雌雄激素水平與對照組無明顯差異，這可能是因為在正反饋機制的調(diào)節(jié)下，激素的降解速率增加，體內(nèi)激素水平保持相對穩(wěn)定。相似的調(diào)節(jié)機制在其他三唑類物質(zhì)的研究中也出現(xiàn)過。酮康唑暴露后黑頭呆魚血液中E2水平出現(xiàn)短時間下降(8 d)，并在暴露后21 d恢復(fù)至正常水平[30]。與B1相比，A1、A2和B2對映體對性腺系統(tǒng)的毒性超出了機體的補償機制，體內(nèi)的激素含量低于正常濃度，這說明在100 mg·kg-1bw濃度下，A1、A2和B2長期暴露(28 d)后能夠?qū)︱狎娴男韵傧到y(tǒng)造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害。已有的研究指出，A2對映體的殺菌活性是其他對映體的1 000倍以上，這說明三唑醇對映體對蜥蜴性腺的毒性和殺菌活性具有不一致性，而Li等[31]將三唑醇染毒大型溞后發(fā)現(xiàn)A2對映體的毒性高于A1，即殺菌活性和水生毒性具有一致性，這表明，三唑醇在不同物種中的代謝模式不同，導(dǎo)致不同對映體的生物毒性有差異。從上述結(jié)果可以看出，三唑醇4種對映體對麗斑麻蜥性腺系統(tǒng)的影響具有明顯的對映選擇性，類似的對映選擇性也存在于其他手性物質(zhì)中。Song等[32]比較了9種手性農(nóng)藥與ER和甲狀腺激素受體(TR)結(jié)合力的大小，發(fā)現(xiàn)其中7種手性農(nóng)藥與ER的結(jié)合具有對映選擇性，2種手性農(nóng)藥與TR的結(jié)合具有對映選擇性。Wang等[33]將聯(lián)苯菊酯(bifenthrin)的不同對映體染毒斑馬魚后發(fā)現(xiàn)，S-bifenthrin具有比R-bifenthrin更高的雌激素活性。Zhao等[34]通過分子模擬實驗進一步揭示了聯(lián)苯菊酯不同對映體與ER在氫鍵和鹽橋形成位點上的差異，這導(dǎo)致它們與ER結(jié)合力的不同。因此，三唑醇不同對映體之間結(jié)構(gòu)的差異可能導(dǎo)致它們與體內(nèi)相關(guān)酶和受體的親和力不同，從而具有不同的生物活性和毒性。

圖2 三唑醇外消旋體及4種對映體暴露28 d后麗斑麻蜥體內(nèi)睪酮(T)和雌二醇(E2)水平注：*表示與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 2 The plasma concentration of testosterone (T) and estradiol (E2) after exposure to triadimenol racemate and its four enantiomers for 28 dNote: *indicates significant difference compared with the control (P<0.05).

圖3 性腺中睪酮和雌二醇合成路線圖Fig. 3 The synthesis of testosterone and estradiol in lizard gonads

外消旋體暴露后蜥蜴GSI顯著降低，性腺中性激素合成相關(guān)基因的表達受到明顯的抑制作用，而相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，外消旋體與A1對映體對性腺中基因的影響具有較強的相關(guān)關(guān)系(0.714，P<0.05)，這說明A1可能是外消旋體中產(chǎn)生生物毒性的主要成分。綜上，三唑醇外消旋體及其對映體對麗斑麻蜥性腺系統(tǒng)的影響具有明顯的對映選擇性，因此，從手性層面研究手性農(nóng)藥的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)具有十分重要的意義。